[发明专利]一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(Lipase)是催化酰基甘油酯水解为脂肪酸和甘油的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。脂肪酶催化反应具很广的底物范围，在催化底物合成和水解时不需要辅助因子，在有机溶剂中有很高的稳定性，在催化反应过程中具有立体特异性和区域专一性等特点。由于脂肪酶具有以上优点，近年来脂肪酶的应用范围不断拓宽，不仅能用于人们的日常生活中，如作为洗衣粉添加剂和污水处理等，还能广泛的应用于精细化工、生物柴油、医药工业、食品工业等行业中。脂肪酶作为一种重要的工业用酶在全球酶制剂市场位列第三。

高性能工业用酶的开发和利用是目前生物技术领域研究的热点之一。微生物酶与动植物酶相比性质更稳定，更易获得和更加安全，因此微生物来源的酶比动植物来源的酶具有更广泛的用途。但目前全球仅有2%的微生物作为酶源并被鉴定。从环境中筛选出有价值的产酶微生物变得尤为重要。我国产脂肪酶微生物品种少，活力较差，急待加强微生物育种的研究。

筛选脂肪酶产生菌常用的方法主要有透明圈平板筛选法和生色圈平板筛选法。由于透明圈(或变色圈)有效直径的大小与酶活对数呈线性关系，可根据透明圈(或变色圈)直径对酶活进行定性和定量分析，以粗略筛选出高产脂肪酶菌株。传统细菌鉴定的主要依据是形态结构、行为习性、生理生化及培养特征等表型。随着分子生物学的发展，分子分类正成为分类学的主要方法，越来越受到重视，如16S rDNA相似性。目前，研究菌株分类地位最有效的方法就是把特征序列放到系统发育树中，考察与其它菌株之间的关系，再结合其它分类信息来最终确证其分类地位。随着核酸测序技术的发展，16S rDNA序列越来越多地被用于细菌的系统进化研究并已成为确立细菌新分类单位的必要数据；随着互联网的迅速发展，我们可以很快捷、容易地从一些大型数据库如核糖体数据库计划(Ribosomal Database Project,RDP)或EMBL/GenBank获得相关菌株的16S rDNA序列用于构建系统发育树。

微生物脂肪酶生产主要有固、液两种发酵方法。霉菌是固态发酵脂肪酶主要菌种，而细菌和酵母则主要采用液态深层发酵。发酵条件的优化对于微生物产脂肪酶十分重要。微生物产脂肪酶发酵除受温度、pH、溶氧影响外，其产量深受培养基组分影响。

因此，提供一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法具有现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种脂肪酶高产菌株、其筛选方法及用该菌株发酵生产脂肪酶的方法。该菌株为一株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ZGP-Y3，保藏编号CCTCC NO.M2013072。该菌株是从石油和油污样品中经富集培养、平板筛选和划线纯化筛选而得，并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定。采用该菌株摇瓶液体发酵48小时后，发酵液酶活达195.69U/mL。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脂肪酶高产菌株，其保藏编号为CCTCC NO.M2013072。

本发明还提供了一种保藏编号为CCTCC NO.M2013072的脂肪酶高产菌株的筛选方法，取石油或油污在橄榄油液体富集培养液中富集，稀释后涂布于丁酸筛选培养基培养后，挑取透明圈直径最大的菌落，经纯化即得。

作为优选，1L橄榄油液体富集培养液中包括：(NH₄)₂SO₄1.0_g、NaCl0.5g、MgSO₄0.1g、K₂HPO₄1g、橄榄油0.01L。

在本发明的一些实施例中，富集的次数为至少3次。

作为优选，稀释倍数为10^-7-10^-11倍。

作为优选，1L丁酸筛选培养基中包括：酵母提取物1.0g、(NH₄)₂SO₄1.0g、NaCl 0.5g、MgSO₄ 0.1g、K₂HPO₄ 1g、琼脂15g、三丁酸甘油酯0.01L。

本发明还提供了一种脂肪酶的发酵生产方法，包括如下步骤：