[发明专利]姜片虫PCR-DHPLC检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品和水生植物中姜片虫的检测方法，尤其涉及利用PCR及变性高效液相色谱（DHPLC）技术检测食品和水生植物中姜片虫的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。

背景技术

食品和农副产品中的有害生物主要包括细菌、病毒和寄生虫，据世界卫生组织1999年公布的人兽共患病中，有人兽寄生虫共患病58种，据解放军第四军医大学在2004年4月-2005年2月调查我国人兽寄生虫共患病91种。人兽共患寄生虫病，对公共卫生、人民健康、社会安定均带来严重的威胁和危害。

姜片虫即布氏姜片虫，属于扁形动物门吸虫纲复殖亚纲，是一种人兽共患的寄生虫，是寄生在人、猪小肠内的大型吸虫。姜片虫中间宿主是扁卷螺，成熟尾蚴逸出螺体后，附着在水生植物或其他食品的表面形成囊蚴。人或猪因饮用含活囊蚴的生水或生食含活囊蚴的水生植物而感染。成虫寄生于小肠，可引起姜片虫病。当人和猪小肠内寄生的姜片虫性成熟后，便从其生殖孔产出虫卵，随粪便排出体外。姜片虫卵在自然水体中进行发育，遇到适宜的中间宿主——扁卷螺便主动钻入螺体内，最后发育为许多尾蚴；尾蚴自螺体陆续逸出，用它的尾部摆动在水中游动，遇到水中物体，如水生植物——菱角、荸荠以及水草等，便吸附于其表面，脱落尾部，形成囊蚴。当人因生食水生蔬果，特别是用牙咬剥菱角、荸荠等的外皮时或喝生水，便可将姜片虫囊蚴一并吞食而感染。猪也是因喂以青饲料（水花生、水浮莲、浮萍、菱叶以及各种水草等）而感染。姜片虫对人的致病作用，因感染程度不同而轻重不一，有的可无明显症状，有的则极严重甚至死亡。姜片虫病流行于亚洲。在我国以种植和有生食水生蔬果习惯及给猪喂以青饲料的地区流行较严重。

我国对食品中姜片虫的检测技术仍处于比较落后的阶段，检验方法还只限于传统的形态学检测，主要是应用浓缩集卵法和显微镜镜检法，检测水生植物等食品中的姜片虫囊蚴，包括反复离心、反复洗涤、浓缩集卵和显微镜观察的检验过程。检测步骤繁琐，方法灵敏度低；结果判断主要依据形态学检验，对于检验人员专业能力要求高且易受主观经验影响。采用ELISA方法检测寄生虫卵，特异性差、易出现假阳性。PCR-凝胶电泳检测方法虽然检测成本低，但反应产物电泳处理极易造成污染；特异性强，灵敏度高的PCR方法，也存在检测成本较高，荧光探针保存时间较短等问题。

发明内容

为了解决上述实际问题，本发明即旨在利用PCR和DHPCL技术，针对食品和水生植物中姜片虫建立引物对，以及灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。建立可快速简便、灵敏检测食品和水浮莲、浮萍、荸荠和菱角等水生植物中姜片虫的快速检测方法。本发明运用变性高效液相色谱（DHPLC）采用离子对反相高效液相色谱的原理，通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。与传统的姜片虫检测及鉴定方法如形态学鉴定、免疫学技术、PCR-凝胶电泳等检测方法相比，本发明建立的方法及试剂盒，极大缩短了操作的时间，而且大大降低假阳性和假阴性结果的出现，使得结果更加准确、可靠。

本发明的技术方案为：提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用姜片虫的特异性检测引物进行PCR扩增，再用DHPLC技术采集目的基因的图谱信息，直接从图谱信息读取姜片虫的检测结果，在此基础上，本发明还对此方法进行了特异性和灵敏度检测；其具体操作步骤如下：

本发明的一方面在于：提供一种姜片虫检测引物，具体为以下碱基序列：上游引物，SEQ ID NO.1；下游引物，SEQ ID NO.2。

本发明的另一方面在于：提供一种姜片虫检测试剂盒，其包括上文所述的引物SEQ ID NO.1～2。

对于上述技术方案中所述的姜片虫检测试剂盒，包括浓度为5 U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；分别独立包装；其中，所述的PCR反应液为混合液，其中含上文所述引物SEQ ID NO.1～2各10μM之外，还包括10mM Tris·HCl、50 mM KCl、25 mM MgCl₂、dNTP 各2.5 mM。

本发明的另一方面在于：提供一种食品和水生植物中姜片虫的检测方法，其利用上述技术方案中所述的姜片虫引物检测试剂盒，对样品DNA进行PCR方法检测。

对于上述技术方案中所述的食品和水生植物中姜片虫的检测方法，其包括以下操作步骤：分别对样品按下述方法进行PCR检测：

①PCR反应体系为25μL，其中：