[发明专利]利用干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞分化领域，更具体地，涉及利用细胞外基质诱导人骨髓间充质干细胞成为肝细胞的方法。

背景技术

肝衰竭危害巨大、死亡率高，尚无有效治疗方法，目前包括内科综合治疗、人工肝治疗、抗病毒治疗、肝移植治疗等各种治疗方式均存在一定缺陷。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSC）是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，越来越多的动物及临床研究表明BMSC治疗终末期肝病具有良好的疗效和安全性。其机制在于BMSC能够通过分化为肝细胞和发挥免疫调节作用来修复肝脏。

    目前将BMSC诱导分化成肝细胞的方法很多，但大多是将BMSC接种在普通培养基材上，在这种二维条件下，细胞只能呈单层生长，细胞密度低，分化效果不好，这很大程度上影响了培养细胞的生理功能，使得分化的细胞仅具有部分肝细胞的功能，不能满足基础研究和临床治疗的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、实用、诱导效率高、分化效果好的将骨髓间充质干细胞诱导成为有功能的肝细胞的方法。

首先提供一种细胞外基质在诱导骨髓间充质干细胞成为肝细胞的方法中的应用，所述的细胞外基质为诱导骨髓间充质干细胞所分泌的并且去除了骨髓间充质干细胞的基质。所得到的肝细胞的糖原合成能力和尿素合成能力都高于现有的分化方法，即所得到的肝细胞优于原分化方法所得的肝细胞。

    更具体的，提供一种利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，包括以下步骤：

S1. 明胶涂层交联改性：为了增加细胞外基质的附着力，在细胞培养基材中加入明胶溶液，在培养箱中静置，加入戊二醛溶液和乙醇胺溶液，室温静置，

S2. 诱导骨髓间充质干细胞分泌细胞外基质：在步骤S1所得细胞培养基材中加入完全培养基和骨髓间充质干细胞，培养，加入抗坏血酸继续培养，去除骨髓间充质干细胞，即得骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质，

    S3. 利用步骤S2所得的细胞外基质体外诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞：在含有步骤S2所得细胞外基质的组织培养基材中加入骨髓间充质干细胞和诱导分化培养基，培养两周，再将诱导分化培养基换成成熟培养基培养两周，即得肝细胞，

所述的诱导分化培养基包含以下物质： DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、青霉素、链霉素、二性霉素B。

    所述的步骤S1中的在培养箱中静置的温度为37℃、含二氧化碳量为5%，静置时间为1小时；所述的室温静置的时间为半小时。

    所述的步骤S2中所述的完全培养基包含以下物质：α-MEM基础培养基、特级胎牛血清、青霉素、链霉素和二性霉素B。

    步骤S2中所述的加入抗坏血酸的时间为，培养至细胞密度达到90%时。

    步骤S2中所述的去除骨髓间充质干细胞的方法为将骨髓间充质干细胞分泌的ECM浸泡在含有0.5% Triton X-100和20mM氨水的PBS中，放于37℃、5% CO₂培养箱中静置5 min，最后用PBS洗净。

步骤S3中所述的成熟培养基为DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、制瘤素M、地塞米松、胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠、青霉素、链霉素、二性霉素B。

细胞分泌的ECM不仅含有I型和III型胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、核心蛋白多糖等多种基质成分，而且具有与体内微环境相似的三维结构，同时去除原有细胞后留下的空间能为BMSC诱导分化提供足够的生长空间。在三维的ECM微环境中，成纤维细胞能迅速的形成整合素α₅β₁和integrin与ECM接触，类似其在体内的反应；细胞分泌的脱细胞ECM在BMSC向肝细胞诱导分化过程中调控BMSC行为，从而提高BMSC向肝细胞的诱导分化效率和分化后细胞的功能。使其有望成为生物人工肝的细胞来源。

为了更好地理解本发明，以下对本发明方案结合反应式作进一步的阐释，其不能作为本发明保护范围的限制。