[发明专利]利用干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法

权利要求书

1. 骨髓间充质干细胞自分泌的细胞外基质诱导其成为肝细胞的方法的应用，其特征在于，所述的细胞外基质为诱导骨髓间充质干细胞自身所分泌的并且去除了骨髓间充质干细胞的基质。

2. 一种利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 明胶涂层交联改性：为了增加细胞外基质的附着力，将细胞培养基材中加入明胶溶液，在培养箱中静置，加入戊二醛溶液和乙醇胺溶液，室温静置，

S2. 诱导骨髓间充质干细胞分泌细胞外基质：在步骤S1所得细胞培养基材中加入完全培养基和骨髓间充质干细胞，培养，加入抗坏血酸继续培养，去除骨髓间充质干细胞，即得骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质，

    S3. 利用步骤S2所得的细胞外基质体外诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞：在含有步骤S2所得细胞外基质的组织培养基材中加入骨髓间充质干细胞和诱导分化培养基，培养两周，再将诱导分化培养基换成成熟培养基培养两周，即得肝细胞，

所述的诱导分化培养基包含以下物质：DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、青霉素、链霉素、二性霉素B。

3. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤S1中的在培养箱中静置的温度为37℃、含二氧化碳量为5%，静置时间为1小时；所述的室温静置的时间为半小时。

4. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤S2中所述的完全培养基包含以下物质：α-MEM基础培养基、特级胎牛血清、青霉素、链霉素和二性霉素B。

5. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，步骤S2中所述的加入抗坏血酸的时间为，培养至细胞密度达到90%时。

6. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，步骤S2中所述的去除骨髓间充质干细胞的方法为将骨髓间充质干细胞分泌的ECM浸泡在含有0.5% Triton X-100和20mM氨水的PBS中，放于37℃、5% CO₂培养箱中静置5 min，最后用PBS洗净。

7. 根据权利要求2所述的利用骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法，其特征在于，步骤S3中所述的成熟培养基为DMEM/F12基础培养基、特级胎牛血清、制瘤素M、地塞米松、胰岛素—转铁蛋白—亚硒酸钠、青霉素、链霉素、二性霉素B。