[发明专利]利用酶联免疫斑点法的结核效应T淋巴细胞检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及利用利用酶联免疫斑点法的结核效应T淋巴细胞检测方法。 

背景技术

现有的常规结核病检测方法存在患者取血用量大，患者顺应性较差；另外传统方法对于结核效应T淋巴细胞及免疫功能低下者的误诊率较高，严重影响到肺结核患者的救治。 

T-SPOT.TB是利用结核特异抗原（ESTA-6,CFP-10），通过酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。现有的常规检测方法主要是对肝素锂和肝素钠抗凝全血进行淋巴细胞提取后培养，通过结核特异抗原（ESAT-6/CFP10）刺激结合特异性的效应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素，然后效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与模板预包被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围，通过ELISPOT方法检测出效应T细胞。 

发明内容

本发明的目的在于提出一种精确快速的利用酶联免疫斑点法的结核效应T淋巴细胞检测方法，对抗凝全血中单个核细胞的收集做到最大效应的收集，再进行常规操作，提高淋巴细胞的培养的成活率，并提高效应T淋巴细胞的数量；采用该创新方法提高结核细菌感染、免疫功能不全或低下的检出率，该技术可以显著提高结核筛查的临床诊断应用。 

为达此目的，本发明采用以下技术方案： 

利用酶联免疫斑点法的结核效应T淋巴细胞检测方法，步骤包括： 

A．采集肝素锂抗凝外周血4-8ml，在1600-1800r/min离心28-30min；向装有平衡至室温的4ml的RPMI1640的15ml离心管中倒入4ml肝素锂抗凝外周血，混匀；按照2-3:1的比例小心将上述血样加在4ml的Ficoll淋巴细胞分离液上层，确保上述血样与所述Ficoll淋巴细胞分离液不混合；然后在18℃以2280r/min离心22min； 

B．离心后，吸取中间云雾状的单个核细胞层到15ml离心管中，加入RPMI1640至10ml，混匀，在18℃以1780r/min离心7min； 

C．离心后，弃去上清液，加入1ml的RPMI1640轻缓重旋沉淀，再加入RPMI1640至10ml，混匀，在18℃以1350r/min离心7min； 

D．离心后，弃去上清液，加入0.5-1ml的AIM-V培养液轻缓重旋沉淀制成样品细胞悬液； 

E．制备稀释细胞工作液： 

在1.5ml离心管中加入10μl样品细胞悬液和40μl的0.4%的台酚兰，混匀，取10μl台酚兰和样品细胞悬液的混合物加入血细胞计数板中计算每ml的样品细胞悬液的细胞数量，计数4×4大格含0.1μl样品； 

然后计算细胞稀释需要的体积，并加入AIM-V无血清培养液； 

按照公式：需要的样品细胞悬液量=（每个培养孔需要加入的细胞数量×10^-5×需要使用的稀释细胞工作液量）/（每ml的样品细胞悬液的细胞数量×10^-6）； 

每ml的样品细胞悬液的细胞数量=细胞计数×稀释倍数×10⁴； 

需要使用的稀释细胞工作液量=需加入的孔位数×100μl＋100μl； 

AIM-V无血清培养液量=需要使用的稀释细胞工作液量-需要的样品细胞悬 液量； 

F．向培养板中加入AIM-V培养液、抗原A、抗原B、阳性对照各50μl至培养板中的阴性对照孔、抗原A孔、抗原B孔、阳性对照孔中，再往上面4孔中分别加入100μl稀释细胞工作液，放在37℃的CO2培养箱孵育16-20h； 

G.试剂平衡至室温，用无菌PBS按1:200配制酶标抗体工作液，现配现用，即酶标抗体工作液=需要的孔位数×50μl＋100μl； 

H.取出培养板，弃去孔内液体，用200μl新鲜准备的无菌PBS洗涤4遍，每洗完一次用拍板纸拍干，用加入50μl新鲜配制的酶标抗体工作液，将培养板放2-8℃冰箱孵育1h； 

I.取出培养板，用200μl新鲜准备的无菌PBS洗涤4遍，每洗完一次用拍板纸拍干，每孔加入底物工作液50μl，室温避光反应7min，再以蒸馏水冲洗终止反应，放室温干燥培养板，用放大镜观察结果，进行斑点计数。