[发明专利]利用酶联免疫斑点法的结核效应T淋巴细胞检测方法

权利要求书

1.利用酶联免疫斑点法的结核效应T淋巴细胞检测方法，其特征在于，步骤包括：

A．采集肝素锂抗凝外周血4-8ml，在1600-1800r/min离心28-30min；向装有平衡至室温的4ml的RPMI1640的15ml离心管中倒入4ml肝素锂抗凝外周血，混匀；按照2-3:1的比例小心将上述血样加在4ml的Ficoll淋巴细胞分离液上层，确保上述血样与所述Ficoll淋巴细胞分离液不混合；然后在18℃以2280r/min离心22min；

B．离心后，吸取中间云雾状的单个核细胞层到15ml离心管中，加入RPMI1640至10ml，混匀，在18℃以1780r/min离心7min；

C．离心后，弃去上清液，加入1ml的RPMI1640轻缓重旋沉淀，再加入RPMI1640至10ml，混匀，在18℃以1350r/min离心7min；

D．离心后，弃去上清液，加入0.5-1ml的AIM-V培养液轻缓重旋沉淀制成样品细胞悬液；

E．制备稀释细胞工作液：

在1.5ml离心管中加入10μl样品细胞悬液和40μl的0.4%的台酚兰，混匀，取10μl台酚兰和样品细胞悬液的混合物加入血细胞计数板中计算每ml的样品细胞悬液的细胞数量，计数4×4大格含0.1μl样品；

然后计算细胞稀释需要的体积，并加入AIM-V无血清培养液；

按照公式：需要的样品细胞悬液量=（每个培养孔需要加入的细胞数量×10^-5×需要使用的稀释细胞工作液量）/（每ml的样品细胞悬液的细胞数量×10^-6）；

每ml的样品细胞悬液的细胞数量=细胞计数×稀释倍数×10⁴；

需要使用的稀释细胞工作液量=需加入的孔位数×100μl＋100μl；

AIM-V无血清培养液量=需要使用的稀释细胞工作液量-需要的样品细胞悬液量；

F．向培养板中加入AIM-V培养液、抗原A、抗原B、阳性对照各50μl至培养板中的阴性对照孔、抗原A孔、抗原B孔、阳性对照孔中，再往上面4孔中分别加入100μl稀释细胞工作液，放在37℃的CO2培养箱孵育16-20h；

G.试剂平衡至室温，用无菌PBS按1:200配制酶标抗体工作液，现配现用，即酶标抗体工作液=需要的孔位数×50μl＋100μl；

H.取出培养板，弃去孔内液体，用200μl新鲜准备的无菌PBS洗涤4遍，每洗完一次用拍板纸拍干，用加入50μl新鲜配制的酶标抗体工作液，将培养板放2-8℃冰箱孵育1h；

I.取出培养板，用200μl新鲜准备的无菌PBS洗涤4遍，每洗完一次用拍板纸拍干，每孔加入底物工作液50μl，室温避光反应7min，再以蒸馏水冲洗终止反应，放室温干燥培养板，用放大镜观察结果，进行斑点计数。