[发明专利]检测猪蓝耳病流行病毒与HP-PRRS病毒天津株的RT-PCR引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒分子检测生物技术领域，具体涉及一对检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病疫苗天津株的RT-PCR引物及试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。本病于1996年在我国首次报道。

2006年我国南方部分省份出现养猪场暴发猪“高热病”疫情，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪蓝耳病”（Highly Pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS），其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。依据猪繁殖与呼吸综合征病毒结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分为经典猪蓝耳病病毒和高致病性猪蓝耳病病毒两种亚型，高致病性猪蓝耳病病毒包括高致病性猪蓝耳病病毒江西株（JXA1-R株）、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株（HuN4-F112株）、高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）。目前我国使用的高致病性猪蓝耳病活疫苗有江西株（JXA1-R株）和湖南株（HuN4-F112株）、天津株（TJ株）。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。随着PCR技术研究和应用的深化，该技术在兽医领域得到广泛应用，几乎所有已知的DNA和RNA序列的病毒均可用PCR和RT-PCR方法进行特异性检测、诊断，如口蹄疫、猪瘟、蓝耳、伪狂犬病、细小病毒感染、传染性法氏囊病、禽流感等。

中国专利申请号为200710076592.5，公开了一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列，该引物对包括:由序列为CCCAAGCTGATGACACCTTT的上游引物PVpf和序列为AATCCAGAGGCTCATCCTGGT的下游引物PVpr组成的引物对,探针Pfpb序列为CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA。中国专利申请号为200810032141.6，公开了一种高致病性猪蓝耳病病毒RT-PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含的引物序列为：5’-CGTAGAACTGTGACAACAAC-3’、5’-TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT-3’。使用上述引物只能检测是否感染了高致病性猪蓝耳病病毒，无法判断是否有感染经典猪蓝耳病病毒，或两者共同感染。中国专利（申请号）200910077704.8公开了PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法，该方法使用的引物对为：由序列为CGCACCAGATGGRACCTACTT的上游引物PRRSV-F2和序列为ACGGTGTTCAGTGAGGGCTTT的下游引物PRRSV-R3组成的引物对，以及由上游引物的反向互补序列AAGTAGGTYCCATCTGGTGCG和下游引物的反向互补序列AAAGCCCTCACTGAACACCGT组成的引物对，该引物对经一次反应便能鉴别样本是否是经典猪蓝耳病病毒感染,或者是高致病性猪蓝耳病病毒,或者是两者共同感染。但上述方法未能进一步将高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）与猪蓝耳病其他流行病毒加以鉴别。

发明内容

本发明的目的是提供一对检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病疫苗天津株（TJ株）的RT-PCR引物及试剂盒，经一次反应便能检测样本是否呈高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）阳性，或者呈猪蓝耳病流行病毒阳性，或者上述病毒均呈阳性，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。

本发明的技术方案为：

一对检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-CGTCCGTGTCATCAAGCAGCTC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-AAAAGAGGCACAATAGAGTAAAAGC-3′。