[发明专利]具有吸附重金属离子功能的融合蛋白的构建、表达及其在生物除污中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白，还涉及一种细胞表面展示表达所述融合蛋白的乳酸菌。具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本发明还涉及所述融合蛋白或细胞表面展示表达所述融合蛋白的乳酸菌在制备用于结合皮肤表面有毒重金属的化妆品或药物中的应用。另外，本发明还涉及一种去除皮肤表面有毒重金属的药物或化妆品，所述药物或化妆品包含所述融合蛋白或细胞表面展示表达所述融合蛋白的乳酸菌。

背景技术

随着中国各产业工业化的发展，重金属污染已成为社会十分关注的问题。大量的有毒重金属离子通过水、空气、土壤以及生物链污染到人类赖于生存的动植物产品及水源上，给人们的健康带来潜在的危害。一般来说，重金属污染是指铅、汞、镉、砷等重金属离子的污染。其主要来源一方面是未经处理的工业废水、废气、废渣的随意排放。另一方面则是农业上滥用的农药和化肥。

有毒重金属可以通过水、空气及日常生活用品(眼镜、化妆品、服装、玩具等)对人体皮肤的健康带来诸如角质化、色斑、粗糙、提前衰老等极大危害。由于生活中重金属污染常以慢性中毒的方式影响人类，因此，这种危害又往往容易被人们所忽视。

在动物、高等植物、真核微生物和一些原核生物中存在一些富含半胱氨酸的重金属结合蛋白(如金属硫蛋白、植物螯合素等)。这些重金属结合蛋白可以利用其半胱氨酸残基上的巯基与重金属结合，形成无毒或低毒的络合物。生物体在遇到重金属污染的环境时会持续大量表达结合蛋白，进而减少或清除重金属对机体的毒害。进一步研究显示，部分含组氨酸的多肽也具有结合重金属离子的功能。Sousa等在大肠杆菌中表达6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)的多肽，结果发现，该重组菌吸附镉的含量比对照组的高6-11倍(Sousa et al.，Nature Biotechnololgy，1996，14(8)：1017-1720)。更有趣的是，部分研究显示，含组氨酸残基的金属结合多肽在以串联方式进行重复表达时，其结合重金属能力有增加的趋势(Mejáre and Bülow，TRENDS in Biotechnology，2001，19(2)：67-73)。Kotrba等在大肠杆菌中表达另一个含组氨酸多肽(Gly-His-His-Phe-His-Gly)的二聚体，结果发现，重组菌表面结合镉的含量大概比对照组的高3倍(Kotrba et al.，Applied and Environmental Microbiology，1999，65：1092-1098)。

富含半胱氨酸的金属硫蛋白在重金属解毒方面起着重要的作用，然而，利用基因工程的方法很难在宿主中进行大量重组表达。一方面，金属硫蛋白分子量小，半胱氨酸残基多，难以可溶性表达；另一方面，大量巯基也会阻碍宿主细胞正常的氧化还原途径，严重影响宿主细胞正常生理活动。因此，在宿主细胞表面进行展示表达含组氨酸的金属结合多肽是解决这方面困难的一个有效方法。

乳酸菌是一类能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌，其包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属，在食品工业各个领域中的长期应用已证明其无致病性，被公认为安全级微生物。在人和大多数动物体内及各种人类生活环境中广泛分布。研究发现，乳酸菌具有提供人体必需的营养物质、维持泌尿生殖系统健康、增强机体免疫作用、降低胆固醇含量、改善胃肠道功能以及抗肿瘤作用等多种重要的生理功能。有鉴于其具有极其重要应用价值，从20世纪80年代开始，人们就开始致力于对各种乳酸菌，尤其是乳酸乳杆菌，的生物学特性和分子机制研究。乳杆菌作为表达外源蛋白的理想菌株有其独特的优势：首先，该菌已经进行全基因组测序，其所有的功能基因以及生化途径一清二楚；其次，乳杆菌抗原性弱，不会产生内毒素，宿主本身不会引起强烈的免疫应答；最后，乳杆菌现时已作为一种食品级表达宿主用于表达各种抗原、生长因子以及功能蛋白。

本发明的主要目的就是将包含金属结合多肽十聚体和皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白在乳酸菌表面进行展示表达，皮肤细胞黏附三肽有助于将融合蛋白黏贴在皮肤表面(赵强，等，2003，生物医学工程学杂志，20(3)：384-387)，而金属结合多肽十聚体则能结合皮肤表面的有毒重金属离子，形成无毒的复合物。最后，将结合有毒重金属离子的工程菌从人体皮肤上洗脱，可有效从而减少有毒重金属在皮肤中的积聚及损害，实现生物除污的效果。

发明内容