[发明专利]一种加氧酶基因caceO及其编码的蛋白质和应用

说明书

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及一种加氧酶基因caceO及其编码的蛋白质和应用。 

背景技术

除草剂的使用在减轻农业劳动强度、保证农业正常生产的同时，其残留也带来了严重的作物药害问题，据统计我国每年农田受除草剂药害面积达到3000万亩，其中严重药害面积达到500万亩，每年造成几十亿元的损失，而抗除草剂转基因是解决除草剂药害的最佳途径。氯代乙酰胺类除草剂是一类高效、高选择性的触杀性除草剂，对禾本科杂草具有非常显著的杀除效果。氯代酰胺类除草剂是目前国际上大量使用的除草剂之一，至2007年，年产量与使用面积仅次于有机磷除草剂，居世界第二位，其主要代表品种甲草胺、乙草胺和丁草胺，其中以乙草胺的使用量最大。随着农业劳动力的减少和农业耕种方式的改变，该类除草剂的需求和使用量还将持续增加。 

氯代乙酰胺类除草剂化学性质较稳定，在土壤残留期长，并且该类除草剂及其代谢产物会从土壤迁移进入地下水，造成生活水源污染。研究表明该类除草剂有些品种具有致畸变和致突变性，甲草胺、乙草胺和丁草胺被美国环保局定为B-2类致癌物，异丙甲草胺被定为C类致癌物(USEAP,1994)，因此，环境及农产品中氯代乙酰胺类除草剂残留严重危害人类健康。 

氯代乙酰胺类除草剂对鱼类有很强的毒性，比对哺乳动物的毒性大500-10000倍，因此该类除草剂进入水体将会对渔业资源带来严重的危害。乙草胺和丁草胺对土壤微生物数量及土壤中细菌、放线菌、真菌生长速率均有抑制作用，并显著降低土壤微生物多样性。 

此外，氯代乙酰胺类除草剂如乙草胺和丁草胺对农作物具有较严重的药害，特别是在有机质含量较低的砂型土壤、或用药量过大、或施药后遇持续低温高湿天气时，会严重影响作物的生长，近年来我国因乙草胺和丁草胺因使用不当带来的作物药害时有发生，对农业造成严重的损失。 

因此，土壤和水体环境中氯代乙酞胺类除草剂残留污染严重危害人类健康、破坏生态环境及对作物具有严重药害。获得氯代乙酰胺类除草剂的降解菌株和降解基因在治理除草剂残留，消除其药害技术研发中具有以下作用和功能，（一）通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的能降解氯代乙酰胺类除草剂抗性转基因作物，（二）用于土壤、水体中除草剂氯代乙 酰胺类除草剂残留中间产物的消除，（三）用于有用化工产品及药物合成的生物转化。因此降解基因在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个新的降解甲草胺、乙草胺和丁草胺等多种氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因caceO。 

本发明的另一目的是提供该基因编码蛋白质。 

本发明的又一目的是提供该基因及其编码的蛋白质的应用。 

本发明的目的通过如下技术方案实现： 

一个降解氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因caceO，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 

本专利所用的出发菌株为一株能够降解氯乙酰胺除草剂的细菌菌株Sphingobium sp.DC-2（保藏于中中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012190）。通过多次传代获得了一个该菌株的突变株DC-2MUT(保藏日期2013.4.28，保藏号为：CCTCCNO：M2013164)。菌株DC-2MUT（CCTCCNO：M2013164)失去了降解甲草胺、乙草胺和丁草胺等氯乙酰胺除草剂的能力。菌株DC-2降解乙草胺的第一步反应是在一个加氧酶的催化下生成生成2-氯-N-（2-乙基-6-甲基苯基）乙酰胺。 

降解氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因caceO的获得是采用生现代生物信息学手段获得（技术路线见图1）。即通过比较野生株DC-2和突变株DC-2MUT的基因组信息，寻找在野生株DC-2基因组存在，但在突变株DC-2MUT中缺失的加氧酶基因。首先提取野生株DC-2和突变株DC-2MUT的总DNA，把总DNA进行基因组测序，组装，KEGG数据库比对。测序结果表明，野生株DC-2基因组大小为6,334,837bp，481个scaffold；突变株DC-2MUT基因组大小为6,325,634bp，892个scaffold。