[发明专利]前导序列定点突变的角蛋白酶基因及其编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种前导序列定点突变的角蛋白酶基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

角蛋白酶（Keratinases,EC3.4.21/24/99.11）是一类具有分解角蛋白活性的酶的总称。角蛋白化学结构稳定，不溶于水，其链是以α螺旋或β片层结构组成的，通过二硫键、氢键和其他交联键作用形成非常稳定的高度交联的三维结构，很难被一般的蛋白酶（胰蛋白酶和胃蛋白酶）水解。

目前发现的多数角蛋白酶底物范围相当广泛，除能降解角蛋白外，还可分解弹性蛋白、牛血清白蛋白和酪蛋白等，在饲料领域具有广阔的应用前景，角蛋白酶的市场需求在不断增加。我国羽毛资源极为丰富，家禽羽毛蛋白含量高达85%-90%，含13种主要氨基酸，除蛋氨酸、赖氨酸等4种含量稍低外，其它氨基酸含量均高于鱼粉，是极好的动物蛋白资源。把羽毛粉蛋白质降解，转化为能被畜禽消化利用的饲用氨基酸，是目前国际公认的质量最可靠、效果也较好的一种方法。用角蛋白酶酶解的方法既能提高羽毛粉的营养价值，也能节省物理化学法处理羽毛粉耗费的能源。

角蛋白酶能水解多种蛋白的特性使得角蛋白酶具有潜在的应用前景，但是国内外角蛋白酶的商品化生产程度很低，没有广泛的实际应用，其中主要的一个原因就是天然菌株中角蛋白酶的产量太低，使生产成本高昂，难以商品化生产。目前国内外对微生物角蛋白酶的研究主要集中在构建角蛋白酶基因工程菌上，通过异源表达途径来提高角蛋白酶的产量。在大肠杆菌（pEZZl8）系统中，研究者完成了铜绿假单胞菌角蛋白酶（Sharma,R.and R.Gupta(2010).Extracellular expression of keratinase Ker P from Pseudomonas aeruginosa in E.coli.Biotechnology Letters:1-6.）和地衣芽孢杆菌ER-15角蛋白酶kerBL（Tiwary,E.and R.Gupta(2010).Extracellular Expression of Keratinase from Bacillus licheniformis ER-15in Escherichia coli.Journal Of Agricultural and Food Chemistry.）的胞外表达。角蛋白酶kerA的多拷贝基因在地衣芽孢杆菌T399D和枯草芽孢杆菌DBl04系统中也能分泌表达（Wang,J.J.,K.Rojanatavorn,等.(2004).Increased production of Bacillus keratinase by chromosomal integration of multiple copies of the kerA gene.Biotechnology and Bioengineering87(4):459-464.）。其他研究结果也显示，角蛋白酶基因在毕赤酵母表达系统（Radha,S.and P.Gunasekaran(2009).Purification and characterization of keratinase from recombinant Pichia and Bacillus strains.Protein Expression and Purification64(1):24-31.）、巨大芽孢杆菌表达系统（Radha,S.and P.Gunasekaran(2007).Cloning and expression of keratinase gene in Bacillus megaterium and optimization of fermentation conditions for the production of keratinase by recombinant strain.Journal Of Applied Microbiology103(4):1301-1310.）和链霉菌表达系统（李明珠(2010).弗氏链霉菌S.fradiae S-221角蛋白酶基因的异源表达及酶学性质研究,郑州大学.）中都能分泌表达，角蛋白酶产量比野生型都有所提高。

尽管角蛋白酶基因在上述几种表达系统中都已实现了分泌表达，但是表达量都较低，不能满足规模化工业生产的要求。在异源表达的基础上，通过蛋白质工程在分子水平上对目的基因进行分子改造，也可以提高角蛋白酶产量，但至今国内外未取得突破性进展。