[发明专利]前导序列定点突变的角蛋白酶基因及其编码蛋白和应用

权利要求书

1.一种前导序列定点突变的角蛋白酶，其特征在于，其具有（1）或（2）所示的氨基酸序列：

（1）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

（2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述前导序列定点突变的角蛋白酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述前导序列定点突变的角蛋白酶编码基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pJTU4882-F，其构建方法包括如下步骤：

（1）以载体pBluSK(+)-sfp2为模板，通过反向PCR在角蛋白酶前导序列的第78位点的Leu上下游各15bp处分别引入KpnI和BsmI酶切位点，得到的PCR产物经过DpnI限制性内切酶处理后进行自连，构建得到载体pBluSK(+)-KB；载体pBluSK(+)-KB经过AfeI和BamHI酶切，连入同样经过AfeI和BamHI酶切处理的载体pJTU4882，构建得到表达载体pJTU4882-KB；

（2）合成如下2条单链核苷酸链：

F-1:5′-cttcaacaagttcatcgccggcggcgaggcca-3′

R-1:5′-gcctcgccgccggcgatgaacttgttgaaggtac-3′；

所述单链核苷酸链采用退火互补的方法生成双链DNA，通过T4DNA连接酶将上述双链DNA连入经过KpnI和BsmI限制性内切酶处理的pJTU4882-KB，构建得到带有突变核苷酸的表达载体pJTU4882-F；

其中，步骤（1）中载体pBluSK(+)-sfp2的构建方法为：以F-2和R-2为引物，以弗氏链霉菌基因组为模板扩增角蛋白酶基因，并克隆至pBluSK(+)，构建得到pBluSK(+)-sfp2；

F-2：5’-AACATATGCGCTTCACCCCCCG-3’；

R-2：5’-GGGATCCGTCAGATGATGCTGACG-3’；

步骤（1）中载体pJTU4882的构建方法：将pSP72用XbaI和EcoRI双酶切，回收1700bp的酶切片段，同样将pHZ1358用XbaI和EcoRI酶切得到5424bp的片段，将这两片段连接构建A载体，再将全基因合成的XbaI-Xi启动子-SD-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段通过XbaI和SacI双酶切克隆到上述A载体，构建表达质粒pJTU4882；其中，XbaI-Xi启动子-SD-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，步骤（1）中反向PCR引物如下：

F:5′-cccgggtaccttcaacaagctcatcgccggcggcgaatgcatctacgccgcgggcggc-3′

R:5′-tgaaggtacccggggtgcgcttgatctccacggcgccg-3′；

PCR程序：95℃预变性5min；95℃30s，65℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，步骤（2）中退火互补方法如下：合成的2条单链核苷酸链分别溶于蒸馏水，2条核苷酸链等摩尔量混合，95℃处理5min后室温冷却。

8.含有权利要求4-7任一项所述重组表达载体的宿主细胞。

9.权利要求2或3所述的基因或权利要求4-7任一项所述重组表达载体在提高链霉菌中角蛋白酶表达量中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求2或3所述的基因或权利要求4-7任一项所述重组表达载体转入链霉菌中，使前导序列定点突变后的角蛋白酶基因在链霉菌中表达。