[发明专利]一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及制备直接标记泛着丝粒探针的方法以及在生物医学、辐射生物学领域中的应用。

背景技术

染色体标本荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术在辐射生物学领域中应用较为广泛，该技术具有直观清晰图像、快速高效分析的优点、分裂细胞质量要求不那么严，对镜检分析者要求不高，尤其是判定易位畸变比常规G显带方法要快速、准确，从而解决了剂量估算需要计数大量细胞的难题。目前，FISH技术主要用于回顾性剂量重建，对早先受电离辐射照射人员和慢性受照人员进行剂量估算(International Atomic Energy Agency.Cytogenetic analysis for radiation dose assessment.A manual technical report series No.405.Vienna：IAEA，2001：109-115)。

α-卫星DNA(alpha satellite DNA)是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着丝粒DNA(centromere DNA，CEN-DNA)家族，由171bp的单体为单位组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝粒DNA区域，其中大部分序列高度保守，但是在每条染色体上，其保守序列仍具有一定的差异性(Willard HF，Chromosome-specific organization of human alpha satellite DNA.Am J Hum Genet.1985，37(3)：524-532)。FISH技术中泛着丝粒探针可以与靶DNA紧密结合，杂交信号也较强，易于检测，主要用于检测染色体的数目，分析双着丝粒体和着丝粒环以及应用泛着丝粒探针结合全染色体特异性探针准确区分双着丝粒体和易位。

理想的探针标记物，应具备以下几点：①高度灵敏性；②标记物与核酸探针分子的结合，不能影响其碱基配对特异性；③不影响探针分子的主要理化特性；④当采用酶促法进行标记时，应对酶活性无明显影响；⑤高度特异性(卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993.159)。

现有FISH技术中应用泛着丝粒探针分析辐射诱导后细胞染色体形态时，常用半抗原分子(生物素或地高辛)间接标记探针，探针与染色体原位杂交后需用偶联不同荧光物质的高度特异性和高亲和力抗体进行信号放大反应以及多次洗片，因此具有耗时长、操作步骤繁琐、效率低等问题。

发明内容

本发明的目的在于建立一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法，以解决现有技术中应用间接标记泛着丝粒探针分析染色体形态耗时长、操作步骤繁琐等问题。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：

一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法，包括如下步骤：

(1)、制备荧光基团直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针；

(2)、将步骤(1)所获得的荧光DNA探针与辐射诱导后细胞染色体标本荧光原位杂交；

(3)、荧光显微镜下检测着丝粒及染色体形态。

其中，步骤(1)中所述的荧光基团选自Cy3、Cy5或Fluorescein中的任意一种。

其中，步骤(1)所述的荧光DNA探针的DNA序列来自人类染色体着丝粒区域的α-卫星DNA。

优选的，步骤(1)包括如下两个步骤：

1)以健康人基因组DNA为模板，PCR扩增人α-卫星DNA片段；

2)以步骤1)获得的α-卫星DNA片段PCR产物为模板，PCR扩增溶液中加入带荧光基团的dUTP，获得荧光基团直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针。

其中，所述步骤(2)具体包括细胞染色体制片、老化、变性、杂交、洗片、复染及镜检的步骤。

优选的，步骤(2)中所述杂交具体为：将步骤(1)制备的荧光DNA探针联合全染色体探针与辐射诱导后细胞染色体标本杂交。其中，全染色体探针选自人全染色体探针中的任何一种。