[发明专利]双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮

说明书

一、技术领域

本发明利用发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮的方法属于生物技术领域，涉及利用双液相发酵系统进行发酵降解。

二、背景技术

雄烯二酮的化学结构式如下：

雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用，可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的，其可用来生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用来合成氢化可的松、氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也可以直接用于生产抗早孕米非司酮和各类计划生育药。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药产品，如福美司坦等及类固醇类激素免疫抗原等，目前，全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD作原料生产的医药品种不断增加。

Peterson和Murray在美国专利No.2,602,769中公开了一种用根霉属真菌生产孕酮的II-a-羟化的方法；Kraychy在美国专利NO.3,684,657中公开了一种用分枝杆菌属从包含17-烷基的类固醇生成雄-4-烯-3，17-二酮，雄-1，4烯-3，17-二酮和20a-羟甲基孕-1，4-二烯-3-酮的方法。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17-双酮(雄烯二酮)及雄甾-1，4-二烯-3，17-双酮(雄烯二酮D)并以此作为合成甾体药物的原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到雄烯二酮和雄烯二酮D；70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产雄烯二酮D获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇作为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力已获得很大进展。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解雄烯二酮、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利No.4,293,644中描述了一种通过——分枝杆菌(ATCC29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-双酮(雄烯二酮)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的产物的方法。

国内在这方面也作了一系列的研究。王敬一，殷芝华，周维善在对β-谷甾醇侧链的降解产生4-雄甾-3，17-双酮的研究中发现：雄烯二酮产物的积累与培养基中葡萄糖的多少有关，结果证明葡萄糖过高不利于雄烯二酮的转化。自80年代以来，微生物降解甾醇生成雄烯二酮甾体技术得到充分发展并在工业上得到广泛应用。我国从国内外来源的诸多菌株中筛选到(Mycrobacteriumphlei 93201)，在9α羟化酶抑制剂2，2’-联吡啶存在下能将β-谷甾醇降解为ADD及微量雄烯二酮的菌株。

目前，AD的生产方法国内外有较大的差别，国外主要采用微生物法发酵转化植物甾醇，而国内由于发酵工艺的不成熟，AD的生产厂家仍旧采用从薯蓣植物资源中提取薯蓣皂苷元(简称皂素)，化学合成雄烯二酮。薯蓣皂苷元主要是从穿地龙(一种野生名贵中药材)中提取，消耗量大，已濒临枯竭，因此，采用该方法进行生产AD，严重受到原料的影响。国内也有科研机构在研究利用微生物法发酵转化植物甾醇制得AD的生产方法，但是由于发酵量较小，难以达到工业生产的需求。

利用微生物发酵法降解植物甾醇工业化应用的一个难题是如何解决植物甾醇的溶解性问题：植物甾醇不溶于水，而在发酵过程中，菌株的生长、代谢、繁殖均是在水相中进行，甾醇不溶于水的物理特性降低了菌株对甾醇的利用率。

双液相发酵的研究始于19世纪60年代，是指在发酵液中加入一种新的，与水不相溶的油相，例如以液态烷烃为底物进行SCP生产。目前，发酵生产中双液相发酵体系有三类，第一类是以商品化的以烷烃或油脂为碳源的发酵体系；第二类是氧载体发酵体系，即将对氧有较高溶解度，但又不溶于水的有机溶剂(称为氧载体)称为氧载体加入到好氧发酵体系中，加快发酵体系的氧传递速度；第三类是近几年开始开展研究的，在上述两类双液相发酵体系中引入一种固体载体或乳化剂，利用这种载体所具有的很强的与水和油的双重吸附能力，增加双液相间的接触面积，从而提高传质与发酵产率。

三、发明内容