[发明专利]一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用。

背景技术

血栓性疾病(thrombotic disease，TD)危害心、脑、肺的血管系统，造成急性心肌梗塞、脑梗塞、脑血栓形成、肺动脉栓塞、肢体静脉血栓等疾病。目前临床上用于血栓预防和治疗的药物主要分为3类：抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物。现有溶栓药物还存在缺乏特异性、出血副作用强、药剂量难以控制、半衰期短、易出现再栓塞等问题。

方格星虫（Sipunculus nudus）是一种海洋底栖无脊椎动物，隶属于星虫动物门（Sipuncula），方格星虫纲（Sipunculida），星虫科，方格星虫属动物。生活在沿海滩涂一带沙泥底质的海域，涨潮时钻出，退潮时潜伏在沙泥洞中，俗称沙虫、光裸星虫、沙肠子。已报导的大约有300种隶属为全球分布种类，在我国沿海均有分布。星虫有较高药用功效和食疗价值。它性寒，味甘、咸，有滋阴降火、清肺补虚之功效。星虫体内富含多种活性物质，具有抗击疲劳、延缓衰老、增强免疫力、滋阴降火以及清肺化痰等功效。

国内外对方格星虫的研究主要集中在形态解剖学特征、繁殖生物学及生理生化等方面。关于星虫纤溶酶相关专利有李肖肖、雷丹青等从方格星虫中提取的纤溶酶（专利号：CN101892210A）其分子量在27-35kDa之间。牛荣丽、唐景财廖共山等从革囊星虫内脏中提取出具有激酶和直接溶解纤维蛋白活性的纤溶酶（专利号：CN102002488A）其分子量在28-32kDa之间。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种方格星虫纤溶酶。

本发明提供的方格星虫纤溶酶，为具有如下1）或2）特征的纤溶酶：1）其分子量为20KDa-25KDa；2）等电点为3.0-3.5。

上述方格星虫纤溶酶，为具有如下1）或2）特征的纤溶酶：1）其分子量为24917Da；2）等电点为3.211。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述方格星虫纤溶酶的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）将离体的方格星虫内脏依次进行匀浆、盐析，收集盐析产物；

2）将所述盐析产物依次经离子交换柱层析和凝胶柱层析，得到方格星虫纤溶酶。

上述方法中，所述离子交换柱层析为阴离子交换柱层析；

所述阴离子交换柱层析为将所述盐析产物流经阴离子交换柱，用含0.1-1M NaCl的浓度为0.02M、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，检测阴离子交换柱洗脱产物活性，收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物；所述线性洗脱的时间为20h，所述线性洗脱的流速为0.5mL/min；所述阴离子交换柱具体为DEAE-Sepharose FF，

所述凝胶柱层析为将所述阴离子交换柱洗脱产物流经葡聚糖凝胶柱，用浓度为0.02M、pH值为7.5的PBS缓冲液洗脱，检测葡聚糖凝胶柱洗脱产物活性，收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物；所述洗脱的时间为6h，所述洗脱的流速为1mL/min；所述葡聚糖凝胶柱具体为Sephadex G-50，

所述检测洗脱产物活性采用的方法具体为纤维素蛋白平板检测，若形成透明圈，则有活性。

上述收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物为每10min收集一管洗脱产物，收集第45-50管洗脱产物；

上述收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物为每10min收集一管洗脱产物，收集第18-22管洗脱产物。

上述方法中，步骤2）中，在所述离子交换柱层析步骤前，还包括将所述盐析产物溶解后透析除盐的步骤；所述溶解采用的pH值为7.5、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液。

在所述阴离子交换柱层析中，在所述检测阴离子交换柱洗脱产物活性的步骤前还包括：将线性梯度洗脱的产物透析除盐的步骤；

在所述凝胶柱层析中，在收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物的步骤后还包括：将所述具有活性的凝胶柱层析洗脱产物透析除盐、干燥，得到方格星虫纤溶酶的步骤。

上述方法中，所述透析采用截留分子量为10kDa的透析袋。上述干燥为冷冻干燥。

上述方法中，步骤1），所述匀浆为将所述方格星虫的内脏与pH为7.5、浓度为0.02mol/L的磷酸缓冲液混匀后匀浆，离心收集上清液A；

所述盐析包括如下步骤：

A、向所述上清液A加入硫酸铵至质量百分含量为30%，混匀、静置、离心收集上清液B；