[发明专利]一种抗杂色曲霉素的单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，具体而言涉及抗杂色曲霉素单克隆抗体ASH，还涉及该单克隆抗体在制备杂色曲霉素检测试剂盒中的应用。

背景技术

目前已知污染谷物的霉菌毒素约有100种，霉菌毒素是霉菌的代谢次生物。饲料中的霉菌毒素除了引起动物霉菌毒素中毒，大部分还可抑制动物免疫，降低抵抗力，从而诱发其他疾病。动物试验表明：霉菌毒素能引起心率减慢、呼吸加快、脱毛和流产等症状。霉菌毒素还可在畜产品中残留，间接危害人类健康。

杂色曲霉素(Sterigmatocys简称ST)是一种杂环化合物具有很强的肝及肾脏毒素，能诱发多种肿瘤。南非某些地区的肝癌高发可能与ST有关。杂色曲霉素是，可导致胆管癌和肝癌，有致突变性，但对食品的污染频率较低。ST还可转化成更强烈的致癌物黄曲霉毒素。ST还能引起一些动物疾病。ST可有10多种真菌代谢产生，在人工培养基的产量高达10g/kg。已知可被ST污染的食品包括：大米、小麦、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等。杂色曲霉素经三氯化铝喷雾后加热，可在365nm波长紫外光下呈黄色荧光。卫生研究所建立的检测杂色曲霉素的薄层色谱法已于1984年列为国家标准(GB/T5009.25-1996)。该法对大米、玉米、小麦的最低检出量为25μg/kg，黄豆、花生为50μg/kg。

由于ST危害大，分布广，要减少其对人畜的影响，有效而快速的检测食物及饲料中的ST就显得非常重要。确诊ST中毒则更有赖于从患者的组织或分泌物、排泄物中检出。与传统应用的生物学检测法、薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等相比，免疫化学检测法对真菌毒素的检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量检测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学检测ST的前提则是需要具备针对ST的抗体。

以食品的天然组分形式存在的天然霉菌毒素则不易被识别，且由于潜在毒性大，从而会对消费者的健康造成很大的威胁。越早进行霉菌毒素检测就越容易将霉菌毒素产生的危害降到最低。如能从源头就发现霉菌毒素，则更便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的饲料给养殖业带来危害，从而使企业包括食品安全蒙上阴影。

实际操作中，如果在饲料原料采购环节就采用快速筛选的方法，查看饲料原料是否含有霉菌毒素，则可以使企业避免使用含霉菌毒素的原料生产饲料。所以，研制对霉菌毒素快速、高灵敏、高特异性的检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明公开了一种抗杂色曲霉素单克隆抗体ASH，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明还公开了上述单克隆抗体ASH的制备方法，主要包括如下：

1.抗杂色曲霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

1)抗原的制备(BSA-ST)

将ST与稀硫酸在热水浴中回流衍生成ST半缩醛衍生物，ST半缩醛衍生物经过硅胶G层析柱纯化后在中性磷酸盐缓冲液中(PBS)与牛血清白蛋白(BSA)反应5小时，低温下加入NaBH4还原，再用稀盐酸除掉过量的NaBH4，然后兑水透析，备用。由此得到复合抗原BSA-ST，分装冻干，免疫动物。用紫外吸收光谱确定BSA与ST的偶联率。

2)动物免疫

5只BABLC用BSA-ST进行免疫，200μg/只/次，免疫4次，进行小鼠尾血效价测定。最终要求ELISA效价达到1∶25600以上。

3)饲养层细胞制备(融合前一天制备完成)

将未经免疫的小鼠(BALB/C或昆明小鼠)拉颈处死，摘除眼球取血。将未经免疫的小鼠用75％酒精浸泡消毒，取出后放在超净工作台内的无菌培养皿中。剪开小鼠腹部皮肤(不要损伤腹膜)、沿切口上下撕开皮肤，充分暴露腹部，换剪刀、镊子，剪开腹膜，切口大小可以允许尖吸管随意进出，取一只尖端平整的尖吸管吸一管培养液，加到小鼠腹腔中，涮一涮，吸出，反复几次(一般2～3次)，注意不要戳破小鼠消化道，污染细胞。离心收集的饲养层细胞，弃上清，将细胞悬于HAT培养液中，台盼蓝染色计数活细胞，根据活细胞量进行稀释，使每毫升含约40万个活细胞。混匀后倒入灭过菌的排枪槽用排枪将细胞悬液加于96孔培养板的小孔中(或用滴管滴入96孔培养板的小孔)37℃，饱和湿度的培养箱中培养备用。

4)免疫脾细胞的制备