[发明专利]一种斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的高效表达技术

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域重组蛋白质的表达和纯化技术，具体地说，是一种斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的高效表达技术。

背景技术

    抗菌肽是由生物细胞特定基因编码的一类具有强抗菌作用的小分子多肽，其抗菌谱广、无耐药诱导性、分子量小而耐热性好，且具免疫调节功能，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了重要作用，被认为是饲用抗生素替代品的最佳候选者，因此，极具开发应用前景。

hepcidin抗菌肽的特点是分子量小、富含半胱氨酸、带正电荷，属于β-防御素家族，其分子内由4对二硫键形成的β-环状结构与抗菌功能有关；由于它兼具广谱抗菌和对铁代谢的负调控作用而越来越受到关注。hepcidin最初是从人的血浆和尿液中分离获得，其成熟肽被确定由25个氨基酸残基组成。随后，有其他哺乳动物和一些鱼类如虹鳟、斑马鱼、鮰鱼和罗非鱼的关于hepcidin的研究报道，但大多数仅局限于从生物中提取或对其编码基因的克隆方面。即便是做原核或真核的重组DNA表达，因为考虑到密码子的偏爱性，大多数也是使用合成的DNA，而非克隆的天然抗菌肽基因，且表达量都很低。

鱼类抗菌肽是鱼类先天免疫的重要组成部分，使用抗菌肽作为绿色饲料添加剂用于水产养殖鱼类的疾病防治，具有广阔的应用前景。中国专利文献CN201010505548.3，公开日2011年2月16日，公开了一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法。该hepcidin抗菌肽的制备步骤包括：克隆大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，构建重组载体，转化宿主细胞，挑选阳性克隆进行原核表达，分离纯化表达产物，获得大黄鱼hepcidin抗菌肽，解决了大黄鱼hepcidin抗菌肽表达复性时会有蛋白析出的问题。但是关于本发明斑点叉尾鮰（英文名Catfish，学名Ictalurus punctatus）hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的高效表达技术，还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种采用原核表达系统高效表达具有生物学活性的斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽的基因工程技术，即斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的高效表达技术。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的高效表达技术，包括以下步骤：

（1）通过RT-PCR获得来自斑点叉尾鮰肝脏的编码hepcidin成熟肽的天然cDNA片段，构建融合表达载体pET32a-mCH，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达的重组融合蛋白TrxA-mCH经Ni-IDA亲和层析，得到纯化；

（2）采用肠激酶对纯化的融合蛋白TrxA-mCH进行处理，以除去融合头，同时通过添加尿素，使目的肽得到正确的折叠；

（3）通过分子筛层析对酶切混合液进行分离，得到纯化的目的肽产品mCH。

步骤（1）中所述的IPTG诱导表达的温度为30℃。

步骤（2）中所述的肠激酶处理的反应体系为：经Ni-IDA亲和层析纯化的融合蛋白TrxA-mCH、肠激酶、25mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、2mmol/L CaCl₂、1mmol/L二硫苏糖醇、终浓度为1mmol/L的尿素；反应温度为25℃，反应时间为16h；肠激酶的用量为每50μg融合蛋白一个酶活单位。

本发明优点在于：

1、本发明方法采用了通过PCR获得的编码斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽的天然cDNA，在原核表达时采用了相对较高的30℃作为表达温度，表达效果好；

2、由于目的肽含有8个半胱氨酸残基，很容易形成分子间的二硫键，因此，在对融合蛋白进行肠激酶处理时，添加适量浓度的二硫苏糖醇（DTT），以防止分子之间的聚合；同时添加了尿素，使目的肽在融合蛋白状态下得到正确折叠，避免了通常采用的复杂复性步骤；

3、本发明应用基因工程技术在原核细胞中高效表达了斑点叉尾鮰hepcidin的成熟肽mCH，产品经抗菌活性测定，对革兰氏阳性和阴性细菌具有明显的抑菌效果，对于绿色饲料添加剂在水产养殖中的使用来说具有重要的实际应用价值。

附图说明

附图1是重组融合表达载体的构建图。