[发明专利]一种原人参二醇的生物合成方法及其生产菌株

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种原人参二醇的生物合成方法及其生产菌株。

技术背景

原人参二醇（protopanaxadiol,PPD）为二醇型人参皂苷元，主要来源于人参、西洋参等五加科植物。人参皂苷是一种有多种药理活性的四环三萜类化合物，按化学结构可分为原人参二醇型、原人参三醇型和齐墩果酸型三类。原人参二醇是二醇组人参皂苷的苷元，也是二醇组人参皂苷经微生物酵解后的最终产物，有20(S)和20(R)2种差向异构体，它们均属于达玛烷型四环三萜类化合物，其中，20(S)–原人参二醇活性最强。药理实验证实，20(S)-原人参二醇有抑制多种癌症生长、抗抑郁、激活氯离子通道、抑制被激活的钠通道去极化、抑制人胚肾、HEK-293细胞生长和幽门螺旋杆菌生长等诸多活性。

作为原人参二醇主要来源的人参、西洋参等需要4到15年的生长栽培阶段，生产上由于连作障碍和病虫害的困扰，品质及其生长环境受到严重限制；同时具有药理活性的原人参二醇在人参、西洋参等中的含量稀少。总之，原人参二醇的获得存在着生长周期长，原材料含量低，提取技术复杂，纯度较低等困境。

近年来，植物次生代谢工程发展迅速，应用分子生物学和基因工程方法，在微生物中重建药用次生代谢产物生物合成途径已有初步的研究和实践。三萜皂苷生物合成途径及其关键酶的研究不断取得进展，为通过次生代谢工程手段生产原人参二醇奠定了基础。

原人参二醇的生物合成途径包括三个关键步骤，分别为2，3-环氧角鲨烯（2，3-oxidosqualene）的生物合成（由2，3-环氧角鲨烯合成酶（2，3-oxidosqualene synthase,简称SS）催化），达玛烯二醇（Dammarenediol-II）的生物合成（由达玛烯二醇合成酶（Dammarenediol-II synthase，简称DS）催化），原人参二醇（protopanaxadiol）的生物合成（由细胞色素P450合成酶（CYP716A47）催化），具体的合成路径如附图1所示。

与其他微生物相比,毕赤酵母（Pichia.pastoris）生长快、安全性高,且为模式生物，其代谢调控研究得比较清楚，特别是毕赤酵母自身能够合成达玛烯二醇的前体2,3-氧化角鲨烯,从而省去原人参二醇生物合成的第一个关键步骤，因此它是一种理想的用于合成原人参二醇的异源表达宿主，对于大规模生产原人参二醇具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种原人参二醇的生物合成方法，并提供用于生产原人参二醇的重组菌株。

本发明通过将达玛烯二醇合成酶基因和P450细胞色素合成酶基因进行克隆并在毕赤酵母中共表达，构建了能合成原人参二醇的重组菌株，也为实现原人参二醇的大规模工业化生产奠定了基础。

一方面，本发明提供了一种生产原人参二醇的重组毕赤酵母工程菌的制备方法，该方法包括下列步骤：

1）构建携带有达玛烯二醇合成酶基因的表达载体；

2）以毕赤酵母为宿主菌株，转化步骤1）得到的表达载体，获得重组表达达玛烯二醇合成酶的毕赤酵母工程菌。

3）构建携带有P450细胞色素合成酶基因的表达载体；

4）用步骤3）得到的表达载体转化步骤2）得到的毕赤酵母工程菌，获得共表达达玛烯二醇合成酶和P450细胞色素合成酶的毕赤酵母工程菌。

通过高效液相色谱和MS分析，结果证明，上述共表达达玛烯二醇合成酶和P450细胞色素合成酶的毕赤酵母工程菌能高效合成原人参二醇，即为本发明所述的生产原人参二醇的毕赤酵母工程菌。

另一方面，本发明提供了一种生产原人参二醇的重组毕赤酵母工程菌，该毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体和含P450细胞色素合成酶基因的表达载体。

本发明中，所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

（b）与SEQ ID NO:1具有95%序列同一性的核苷酸序列。

本发明中，所述的P450细胞色素合成酶编码基因具有：

（a）包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

（b）与SEQ ID NO:2具有95%序列同一性的核苷酸序列。

本发明的一个优选实施方案中，所述的含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体为质粒pPicZa。

本发明的一个优选实施方案中，所述的含P450细胞色素合成酶基因的表达载体为质粒Ppic9k。