[发明专利]AroI基因及与色氨酸操纵子的串联表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高新生物技术，尤其涉及一种AroI基因及与色氨酸操纵子的串联表达方法。

背景技术

在DNA重组技术中，L-色氨酸的合成代谢途径长，调控复杂，因此其生产调节一直都受到影响。通过基因工程和代谢工程相结合构建高产色氨酸工程菌存在许多困难，需要考虑整个代谢网络中各个关键酶的活性调节。色氨酸操纵子是一个阻遏衰减系统，除了含有5个结构基因以外，在其前端还存在一段大约160个碱基的衰减子序列，在色氨酸操纵子内部还存在一个二级启动子，该启动子位于TrpE基因的上游，TrpD基因的末端，这很可能是对色氨酸生物合成进行调节的经济性的需要。色氨酸操纵子中的两个启动子具有不同的强度，启动作用受不同的因子调控，可使基因表达更加有效、协调，而且在不同的生活环境中，不同的启动子精密地调节基因的表达量，对维持细胞的生存起着非常重要的作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供了一种AroI基因及与色氨酸操纵子的串联表达方法。

为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现：AroI基因及与色氨酸操纵子的串联表达方法，其特征在于：所述方法所使用的材料包括菌株、载体、培养基；

所述菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)及谷氨酸棒杆菌LG-332；

所述载体包括pMD18T-simple-Trp cluster载体、pZ8-1(pZ8-1 Shuttle expression vector，containing tac promoter，mcs，E.coli ori from pACYC177，C.glutamicum ori from pHM1519，Kmr)穿梭表达载体；

所述培养基包括固体完全培养基(g/L)、斜面保藏培养基(g/L)、种子培养基(g/L)、发酵培养基(g/L)；

该方法通过以下步骤实现：

1)谷氨酸棒杆菌HYHI感受态制作：

a、取谷氨酸棒杆菌HYHI单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600：0.3；

b、将(1)中菌液按3％接入EPO(20ml水+2.5g甘油+0.1mlTween80+80mlLB)，在18℃恒温振荡器上以120r/min振荡培养28h；

c、取出1～2ml菌液检测OD600是否达到1，当OD600为1时，将菌液冰浴10min；同时冰浴浓度为10％的甘油；

d、取400g冰浴好的菌液，9600r/min离心10min。弃上清，将管倒置于滤纸上，使管内培养液流尽，以收集菌体；

e、每管加入50ml 10％预冷甘油，轻轻吹打，重悬细菌，然后于4℃，4,000rpm离心10min，弃上清，此步骤重复四次；

f、每管加入0.5ml 10％预冷甘油重悬细菌沉淀；

g、分装至100μl离心管中于-80℃保存备用；

2)、DAHP合成酶基因及突变基因谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体的构建：

a、DAHP合成酶基因及突变基因穿梭表达载体引物为：

D1：GGTGGTGGATCCAAAGGAGGACAACCATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCG(下划线为BamHI酶切位点)；

D2：AAACTGCAGTTAC TTGGCTGCTGCTCGGCGTTCC(下划线为PstI酶切位点)；

b、PCR扩增目的基因：以TE溶液稀释100倍的pMD18T-simple-Aro I/Aro I*为模板，以D1、D2为引物PCR条件扩增ZAro I/ZAro I*(带有BamHI和PstI的PCR产物命名为ZAro I/ZAro I*)，回收目的基因片段，并连接、转化、阳性克隆筛选，阳性克隆命名为pMD18T-simple-ZAro I/ZAro I*；

c、目的基因与表达载体pZ8-1的酶切：限制性内切酶BamHI和PstI双酶切重组质粒pMD18T-simple-ZAro I和pMD18T-simple-ZAro I*，同时对pZ8-1载体也于37℃恒温4h进行双酶切，分别按照下表中体系进行加样0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体的目的片段；