[发明专利]一株产菊粉酶细菌的制备方法

说明书

技术领域

本发明所属微生物种类开发技术领域。本发明涉及一株产菊粉酶细菌的筛选和鉴定研究，适合工业化应用。

背景技术

菊粉(Inulin)又名菊糖，源自于菊芋块根，是一种天然果糖聚合物，由D-呋喃果糖分子以β-(2，1)糖苷键连接而成的果聚糖。每个菊粉分子末端以α-(1，2)糖苷键连接一个葡萄糖残基，聚合度通常为2-60，平均聚合度为10，其中聚合度较低时(Dp＝2-9)则可称为低聚果糖。作为一种天然可溶性膳食纤维，菊粉几乎不被胃酸水解和消化，而在结肠中被大量有益微生物发酵，因而具备多种保健功能，如控制血脂、降低血糖、改善肠道功能、促进矿物质吸收等。菊粉不仅可以作为脂肪替代品应用于低能量食品生产，而且具有膳食纤维以及益生素的生理功能，是一种优秀的功能性食品基料。目前，菊粉广泛应用于医药保健业、食品工业等领域。。

菊粉酶(Inulinase)是能够水解β-2，1-D-果糖苷键的一类酶，学名为β-2，1-D-果聚糖酶。它主要来源于菊科植物的组织和部分微生物。来源于植物的菊粉酶，其底物专一性较强，仅作用于菊粉；而由微生物产生的菊粉酶大部分都能水解含有β-2，1呋喃果糖苷健的糖，如菊糖、蔗糖和棉子糖，小部分仅能水解菊糖。菊粉酶按其水解果糖苷键的方式不同，可分为内切和外切两类。外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)作用于菊粉链果糖末端的糖苷键，逐一水解释放出果糖，直至最后的葡萄糖，主要产物为果糖；内切菊粉酶(EC 3.2.1.7)仅作用于菊粉，随机断开菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要是菊粉型的低聚三糖、四糖和五糖。因此可通过菊粉酶的催化作用，以菊粉为原料，生产高果糖浆、低聚果糖、乙醇、丙酮-丁醇或琥珀酸等产品。这些产品由于具有广阔的应用前景，促使国外很多学者从20世纪80年代就开始深入开展菊粉酶的研究。毫无疑问，微生物合成是生产大量的工业用酶的唯一方法，30年来许多学者致力于寻找生产菊粉酶的最好微生物，尤其是日本、韩国和欧洲在这方面积累了丰富资料。我国关于菊粉酶的研究始于20世纪90年代，主要研究集中于菌株筛选和酶学性质方面，并且正日益受到人们的重视。但目前能在工业中应用的产菊粉酶的菌株筛选和发酵研究进展比较缓慢，因此选育优良的产菊粉酶菌株和发酵条件是菊芋生产乙醇工程的核心环节。

我们从从自然界中选育得到了一株高产菊粉酶的细菌菌株，目前还没对该菌株产菊粉酶进行相关报道。

发明内容

1.本发明涉及一株产菊粉酶细菌的制备，其特征在产菊粉酶细菌的制备方法，包括以下过程：

步骤(一)：在滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌20天；

步骤(二)：取步骤(一)土壤5克于内置50毫升无菌蒸馏水烧杯中，160r/min摇床震荡分散20分钟；

步骤(三)：取步骤(二)稀释液0.2毫升涂布于筛选培养基，30℃培养5天，利用透明圈法初筛出菊粉酶活力较高的菌株，平板划线方法纯化培养，移入斜面保藏；

步骤(四)：将步骤(三)纯化后菌种接种于PDA培养基上培养5天，进行复筛；

步骤(五)：挑取步骤(四)中的菌株接种于发酵培养基进行发酵培养，30℃、160r/min摇振培养6d，提取菌株的总DNA作为模板，利用通用引物进行PCR反应，纯化；

步骤(六)：将步骤(五)纯化后的PCR产物送上海生工生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对得出菌名；

步骤(七)：鉴定后的菌种保存备用。

2.根据本发明所述1，该菌株的16S rDNA序列长度为1455bp，产菊粉酶的该菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

3.根据本发明所述1，该菌株产菊粉酶的最佳发酵条件是：菊粉30.0g/L，酵母膏7.0g/L，NaCl 5.0，K₂HPO₄·3H₂O3.0g/L，初始pH6.0，250mL发酵三角瓶装液量为50mL，在30℃，160r/min振荡培养2d。

附图说明

图1是B1菌株16S rDNA分子生物鉴定结果图，图2是不同碳源对菌株产菊粉酶活力的影响图，图3是不同氮源对菌株产菊粉酶活力的影响图，图4是初始pH对菌株产菊粉酶活力的影响图，图5是培养温度对菌株产菊粉酶活力的影响图，图6不同装液量对菌株产菊粉酶活力的影响图。

具体实施方式