[发明专利]一种快速鉴别文山三七与易混品屏边三七的PCR-RFLP方法无效
申请号: | 201310128370.9 | 申请日: | 2013-04-15 |
公开(公告)号: | CN103173563A | 公开(公告)日: | 2013-06-26 |
发明(设计)人: | 张广辉;杨生超;杨云;陈军文;李翠婷;陈中坚;朱书生;何霞红 | 申请(专利权)人: | 云南农业大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 昆明合众智信知识产权事务所 53113 | 代理人: | 康珉 |
地址: | 650201 云南*** | 国省代码: | 云南;53 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 快速 鉴别 文山 三七 易混品屏边 pcr rflp 方法 | ||
技术领域
本发明涉及物种分子鉴定技术领域,具体涉及限制性内切酶(MluCⅠ和NlaⅣ)对云南省道地药材文山三七及其易混品屏边三七的分子鉴别技术。
背景技术
文山三七是五加科人参植物三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)的干燥根,又名南国神草、田七,是我国重要的名贵中药材之一,明代著名的药学家李时珍将三七称为“金不换”。《本草纲目拾遗》中记载:“人参补气第一,三七补血第一,味同而功亦等,故称人参三七,为中药中之最珍贵者”。三七和人参(Panax ginseng C.A.Mey.)同为人参属植物,但三七活性物质种类比人参多,且含量高,因此被现代中药药物学家称为“参中之王”。
现代医学实践证明,三七对心脑血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统疾病有不同程度的治疗功效,具有抗衰老、抗炎、抗肿瘤方面的药理作用。以三七为原料的药品有云南白药、片仔癀、三七冠心宁、血塞通、七叶神安片、地奥心血康、复方丹参滴丸、东北红药等。除作为药品外,三七也可用于生产保健品和化妆品。
文山三七早已成为地理标志(证明商标)而中外著名,文山三七指云南省文山壮族苗族自治州所产的三七。三七栽培地道性要求严格,在文山壮族苗族自治州以外栽培,其品质和产量大为逊色。因此,文山三七除倍受我国国内制药行业喜爱外,还出口日本、新加坡、韩国、美国、英国、澳大利亚等国家,为我国出口创汇产生了较大的经济效益。
在文山三七分布地区也有一些其他人参属植物,如屏边三七(P.stipuleanatus Tsai et Feng)、竹节参(P.japonicus C.A.Meyer)等,其中屏边三七是现存野生资源最多的人参属植物,在云南省及其周边省份均有分布,市场上常将屏边三七作为文山三七销售。屏边三七的皂苷种类和含量均少于文山三七,因此,屏边三七代替或者混入文山三七中会影响药效。近年文山三七价格暴涨,出现了一些不法商人利用三七的同属和其他属植物的块根冒充文山三七的现象,特别是用屏边三七冒充文山三七(广州市药品检验所.中药材鉴别原色图谱.广州:广东科技出版社,1988,10;扬兆起等.中药鉴别手册(第三册).北京:科学技术出版社,1994,1)。
人参属植物形态特征极为相似,仅根据干燥块根形状很难区别文山三七和屏边三七。因此,急需建立快速、可靠的分子鉴别方法。近年来,随着DNA分子技术的发展,基于PCR的DNA指纹图谱和测序技术已经成功地引用于中药材质量评价研究领域(曹晖等.DNA分子标记技术:一种新的中药分析方法,药物分析杂志,1999,19(5):355-360)。植物核rDNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)包含被5.8SrDNA所分隔的ITS1和ITS2两个片段,ITS1的长度为187~298bp,ITS2为187~252bp,PCR扩增及测序简单易行。ITS序列变异较快,可以提供较丰富的变异位点和信息位点,已经应用于许多被子植物科内、近缘属间及种间关系的研究。
发明内容
本发明针对文山三七原料真伪感官鉴别困难、易混入屏边三七等问题,提供一种可靠的文山三七与易混品屏边三七的分子鉴别方法。
本发明所提供的一种快速鉴别文山三七与易混品屏边三七的PCR-RFLP方法,由待鉴别样本的总DNA提取、PCR扩增、PCR扩增产物纯化、酶切反应、琼脂糖凝胶电泳、分析鉴别步骤组成,所述的PCR扩增采用的引物是ITS引物,所述的ITS引物由正向引物和反向引物组成,所述的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:1所示,反向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示;PCR扩增产物纯化后,将纯化后的PCR扩增产物分成样品1和样品2两等份并均进行酶切反应,样品1中加入限制性内切酶MluCⅠ,样品2中加入限制性内切酶NlaⅣ,两个酶切反应产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳得MluC Ⅰ酶切图谱和NlaⅣ酶切图谱,对酶切图谱进行分析,在MluC Ⅰ酶切图谱中,如果样品1有三条带,大小分别约为450bp、200bp和100bp,且在NlaⅣ酶切图谱中,如果样品2被切为两条带,大小分别约为500bp和100bp,则待鉴别样本为文山三七;在MluC Ⅰ酶切图谱中,如果样品1只有约450bp的一条带,且在NlaⅣ酶切图谱中,如果样品2不能被NlaⅣ酶切开,其电泳条带与用碱基序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和碱基序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物扩增的PCR扩增产物带大小一样,约为750bp,则待鉴别样本为屏边三七。
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