[发明专利]单管荧光PCR技术检测GJB2基因235delC突变的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种探针特异性的实时定量PCR技术检测耳聋相关基因GJB2 235delC突变的方法及其试剂盒。

背景技术

耳聋发病率高，目前证实约60％的耳聋由遗传因素引起，由遗传因素引起的耳聋，30％的患者属于综合征型耳聋(SHI)，70％的患者属于非综合征型耳聋(NSHI)。NSHI中常染色体隐性遗传占75％--80％，即患儿双亲听力正常，但均是致病基因突变的肯定携带者，多散发存在，目前认为约50％的常染色体隐性遗传性NSHI由GJB2基因突变引起，且不同种族、地区的人群存在不同的热点致病位点，对于我国，日本，韩国等亚洲人群，235delC突变位点是GJB2基因的主要致病突变位点，我国的研究资料证实，20-30％的耳聋由GJB2 235delC突变引起，正常听力人群中GJB2 235delC突变的携带者频率为2-3％。因此，临床上检测GJB2 235delC突变可以明确耳聋病因，进而指导临床；尤其是和新生儿期听力筛查的同步检测，可以提高新生期耳聋的检出率，提高出生缺陷的三级预防；对孕期/孕前夫妇进行GJB2 235delC突变检测可以筛查出携带者，进而指导产前诊断，降低耳聋发生率，提高出生缺陷的二级预防。

目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为PCR产物直接测序法。PCR产物直接测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性(RFLP)检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。公开的专利(专利号200810222745.7)采用了等位基因特异PCR技术，在一个PCR反应体系中使用了4条引物，对于多位点检测有优势，但是该方法在PCR反应结束后需要后续的凝胶电泳分析结果，具有开放式操作，凝胶电泳污染环境等缺点，不适合临床推广。相关的专利201010536373.2采用引物特异荧光定量PCR扩增法，针对GJB2基因235突变位点设计野生型引物和突变型引物，对一个待测样本分别用含野生型引物的荧光PCR体系和突变型引物的荧光PCR体系进行检测，通过比较两次反应的Ct值和两者的差值(ΔCt)大小，判断样品是否存在GJB2 235delC突变。该方法具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单的优点，适合临床实验室使用，但是存在检测单个位点突变需要2个PCR反应管实现的缺点。

本方法采用一种采用实时荧光聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测GJB2基因233-235位点C缺失(235delC)突变方法，针对GJB2基因第235位点碱基缺失处设计特异性野生型探针及突变型探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在GJB2基因第235位点碱基两侧翼序列区设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。该方法具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单，检测单个位点突变需要1个PCR反应管实现的优点。适合临床实验室使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GJB2基因235delC突变的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒，可用于临床样本的检测。

本发明的具体技术路线为：

1)GJB2基因(SEQ ID NO：5)第205-265nt区域设计野生型探针及突变型探针，优选地，在GJB2基因第215-255nt区域进行探针设计，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序列。两种探针均覆盖GJB2基因233-235nt区域，其中野生型探针(SEQ ID NO：3)针对GJB2基因235野生型位点，突变型探针(SEQ ID NO：4)针对GJB2基因235delC突变位点。

2)探针5’端标记荧光发生基团FAM或HEX等类似发光基团，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA或BHQl等类似淬灭基团。探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可以是覆盖GJB2基因235位点的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5’端标记的荧光发生基团及其相应的3’端荧光淬灭基团可以是目前本领域中任何可用的荧光基团，如FAM，HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC，JOE，CY5等。可以使用目前常用的Taqman探针，也可以是在普通Taqman探针基础上经过修饰的LNA-Taqman探针，MGB-Taqman探针或现有技术能够在Taqman探针基础上改良修饰的相关探针。