[发明专利]重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组多肽，尤其涉及一种重组Sushi多肽的制备方法。

背景技术

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外层上特有的结构，其化学成分为脂多糖(LPS)。细菌内毒素可引起人体发热、休克甚至死亡，但它又普遍存在且不易灭活，因而在制药和医疗器械制造中内毒素检测尤为重要。此外，内毒素检测也可以用于临床上相关疾病的诊断和预防。

鳖试剂是国际上至今为止检测内毒素最常用的试剂，然而鲎数量有限以及鲎试剂批次间不均一性等局限性，迫切需要开发鲎试剂的替代品。研究表明，鲎C因子(Factor C)是鲎试剂中对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶原，且其N端的3个Sushi结构域是LPS的主要结合部位。Ding利用昆虫表达系统生产重组Factor C用于内毒素检测，并合成Sushi3区域中与LPS结合的34个氨基酸的多肽，可用于内毒素中和与检测。王东宁等利用大肠杆菌表达了Factor C，并证实重组蛋白对LPS有中和活性。尽管大肠杆菌表达重组蛋白具有快速、大量以及低成本等优点，但是由于大肠杆菌中含有LPS，严重限制了该种重组蛋白的大批量生产与应用。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及其在制备重组Sushi多肽中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种重组Sushi多肽的表达质粒体系，包含分别与断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段连接的第一基因和第二基因，其中，所述第一基因和第二基因由用于编码鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因在选定位点断裂而形成。

作为较为优选的实施方案之一，所述用于编码鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因包括用于编码sushi1和/或sushi3区域的基因。

进一步的，所述选定位点可选自对应于鲎C因子序列的第492和第493个核苷酸之间的位置。

如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系的构建方法，包括：

(1)提供第一选定载体，并将鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因序列克隆到所述第一选定载体上，再将断裂蛋白质内含子插入所述基因序列的选定位点，获得第一质粒；

(2)以第一质粒为模板，经PCR获得N片段，以及，Pst I和Nde I分步酶切第一质粒，获得C片段；

(3)另取第一选定载体，并将所述N片段和所述C片段分别克隆到第一选定载体上，而后Pst I和Nde I双酶切分别连接到第二选定载体上，得到两种目标表达质粒。

其中，所述第一选定载体包括PTA₂载体，所述第二选定载体包括pTWIN1载体，但均不限于此。

作为较佳的应用方案之一，该构建方法可以具体包括：

(1)将鲎C因子的CES12的编码基因序列TA克隆到PTA2载体上；

将断裂蛋白质内含子插入所述CES12的编码基因序列的选定位点，得到质粒pTA₂/his-DnaX-CES12；

(2)以所述质粒pTA₂/his-DnaX-CES12作为模板，经PCR得到N端片段，以及，Pst I和Nde I分步酶切pTA₂/his-DnaX-CES12获得C端片段；

(3)将N、C端片段分别经TA克隆到PTA₂载体，并Pst I和Nde I双酶切分别连接到pTWIN1载体上，获得目标表达质粒pTWIN1/his-DnaX-CES12-N和pTWIN1/his-DnaX-CES12-C。

如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系在制备重组Sushi多肽中的应用。

一种宿主细胞，包含如上所述的重组Sushi多肽的表达质粒体系。

一种重组Sushi多肽的制备方法，包括：将如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系于宿主细胞中进行融合表达，获得N端前体蛋白和C端前体蛋白，而后依次经纯化和去内毒素后，再诱导断裂蛋白质内含子剪接反应，获得具有LPS中和活性的目标产物。

作为较佳的应用方案之一，所述N端前体蛋白包含鲎C因子的CES12的N端部分和Ssp DnaX的N端部分及与其直接相连的His6组氨酸标签，所述C端前体蛋白包含Ssp DnaX的C端部分及与其直接相连的His6标签和CES12的C端部分。