[发明专利]HPV16L2重组腺病毒疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的复制缺陷型重组腺病毒的制备方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）属乳多空病毒科，是无包膜的闭环双链DNA病毒。现已明确，高危型HPV如HPV16、18的持续感染与宫颈癌的发生密切相关，被确定为导致宫颈癌的主要病因，其中又以HPV16型最为常见（Bosch F X,J Natl Cancer Inst,1995,87:796–802.）。基于HPV的宫颈癌预防和治疗性疫苗已经开展了很长时间，其中又以HPV的主要衣壳蛋白L1为重点研究对象，目前临床上已经有了比较成功的疫苗诞生，分别是默克公司的四价疫苗和葛兰素史克公司的两价疫苗。

不同型别的HPV L1VLP在空间构想上存在差异，导致了其不可以产生很好的交叉保护，但只是简单的增加L1VLP的价位而谋求增加交叉保护的效果又会增加疫苗的安全风险和副作用，严重制约着基于L1的疫苗的研究。大量的实验证实，HPV16的次要衣壳蛋白L2的N端具有中和多种HPV基因型的交叉中和表位，是很有前景的候选宫颈癌疫苗（Kawana K，Virology,1998,245:353-359）。针对于L2的蛋白疫苗目前已经有报道，并且已经取得了一些阶段性的成果，但是蛋白疫苗纯化工艺繁琐，成本高昂，不利于在发展中国家进行推广，同时其免疫原性较差也严重制约了进一步研究。

本发明试图构建一种成本低廉，同时可有效激发机体产生特异性免疫反应的疫苗。研究表明，复制缺陷型重组腺病毒嗜性广泛，能够感染包括粘膜上皮细胞在内的多种细胞，介导外源基因在细胞内的稳定表达并刺激机体产生特异性体液及细胞免疫反应，重组腺病毒还可将抗原呈递给免疫系统，有效激发局部和远端粘膜表面的特异性免疫反应，被认为是最为理想的免疫载体之一（Xiang Z Q,J Immunol,1999,162:6716-6723）。与此同时，复制缺陷型重组腺病毒基因不与受体细胞基因组发生整合，具有良好的生物安全性（McConnell M J,Human Gene Therapy,2004,15(11):1022-1033.）。此外，重组腺病毒还具有便于大规模培养制备、成本低廉等优点，因此是理想的HPV候选预防性疫苗之一。所以我们确定以重组腺病毒作为HPV16L2基因的病毒载体。

发明内容

为了使SEQ ID No：1序列能够获得高效表达和呈递，本发明提供一种HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗，含有SEQ ID No：1所示核酸序列。

本发明还提供制备上述HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗的方法，包括如下步骤：

（1）将SEQ ID No：1所示的核苷酸序列克隆到腺病毒穿梭质粒中，得到重组腺病毒穿梭质粒。

（2）用步骤（1）制备的重组腺病毒穿梭质粒和pBHGloxΔE1,3Cre质粒共转染腺病毒包装细胞，得到含有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒。

所述腺病毒穿梭质粒是质粒pDC316，所述腺病毒包装细胞是293细胞。

本发明更进一步提供一种HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗，其有效成分为上述HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒。

本发明提供的HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗可用于制备预防和治疗子宫颈癌和食管癌的药物。所述复制缺陷型重组HPV16L2腺病毒应用于制备预防和治疗有一种或多种HPV病毒引起的子宫颈癌以及食管癌的药物制剂，所述一种或多种HPV病毒选自16、18、31和45型。

本发明实现的技术效果如下：

本发明提供的HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒，用于制备HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗，产生良好的细胞免疫和体液免疫，得到良好的预防效果。

附图说明

图1：pDC316-HPV16L2重组穿梭质粒酶切验证结果图；

图2：HPV16L2细胞内蛋白表达Western印迹分析结果图；

图3：HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗细胞免疫结果图；

图4：HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗体液免疫结果图。

具体实施方式

实施例1：含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒的构建