[发明专利]多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物学及免疫学领域，具体地说，涉及一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物及其制备方法。

背景技术

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）可引起脑膜炎、肺炎等侵入性疾病和中耳炎等非侵入性疾病。据联合国统计数据显示，每年有超过一百万的两岁以下儿童死于肺炎球菌引起的疾病。目前，针对肺炎链球菌的主要防御手段为多糖疫苗和结合疫苗，已经证实了前者在成年人中的保护效果，但是对于肺炎链球菌的主要易感人群，婴儿和幼儿中的保护力却很弱。结合疫苗因其可以在婴幼儿中引起有效保护和免疫记忆，自2000年首次问世以来，在全世界许多国家被纳入免疫计划或批准上市。

目前我国仅有7价肺炎球菌结合疫苗被批准上市，仅能保护7个价次，保护范围有限，而象其他10价肺炎球菌结合疫苗13价肺炎球菌结合疫苗Prevenar其血清型组合主要针对欧美发达国家流行情况而设计，对我国特有的血清型缺乏保护。

发明内容

本发明的目的是提供一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物、其制备方法及应用。

本发明的另一目的是提供一种含有上述共轭组合物的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗。

为了实现本发明目的，本发明的一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，其是包括14种不同血清型肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）荚膜多糖和载体蛋白质共价连接形成的共轭组合物；其中，所述14种不同血清型包括1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

本发明的一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，其是由14种不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白质共价连接形成的共轭组合物；其中，所述14种不同血清型为1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

前述的多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，荚膜多糖与载体蛋白质的重量比为1:2-2:1，各血清型荚膜多糖的质量为血清型1：血清型4：血清型5：血清型6A：血清型7F：血清型9V：血清型14：血清型18C：血清型19A：血清型19F：血清型22F：血清型23F：血清型33F：血清型6B=1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2。

前述的多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，所述载体蛋白质应为无毒性，且能与肺炎荚膜多糖结合并且能够引起多糖免疫原性显著升高的蛋白质，同时易于大量获得。本发明的载体蛋白质优选为白喉类毒素或破伤风毒素，更优选为白喉类毒素CRM197。上述蛋白质载体的获得，需经过菌体发酵、超滤、纯化、脱毒等步骤，均为本领域常规技术。

本发明还提供制备所述多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物的方法，分别对14种不同血清型（1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F）肺炎链球菌的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各血清型荚膜多糖分别与载体蛋白质进行共价连接（例如，先将纯化的荚膜多糖化学活化，通过还原胺化法将活化荚膜多糖分别单独结合到载体蛋白上），形成单价共轭物，最后将各型单价共轭物混合，即得多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物。

其中，肺炎链球菌荚膜多糖分离纯化的步骤为：

1）建立肺炎球菌菌种库，采用工作种子进行肺炎球菌发酵；

2）向肺炎球菌发酵液中加入适量的去氧胆酸钠进行杀菌并剥离肺炎荚膜多糖；

3）对杀菌后的发酵液进行离心，去除菌体，收集离心上清，然后进行超滤浓缩；

4）向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为25%～45%，搅拌后离心去除核酸；

5）向上清中加入乙醇使其终浓度达到55%～80%，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀；

6）加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白；

7）向上清中加入乙醇，使其终浓度达到55%～80%，离心后收集沉淀，即得纯化的肺炎球菌荚膜多糖。

还可采用本领域熟知的其它纯化技术，如柱层析等方法对肺炎链球菌荚膜多糖进行纯化。

本发明还提供所述多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物在制备用于预防或治疗肺炎链球菌所致疾病的药物中的应用。