[发明专利]一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法及所用的发酵培养基

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术研究领域，具体的涉及一种微生物发酵高效生产吡咯喹啉醌（PQQ）的方法及所用的发酵培养基。

背景技术

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）是第三类氧化还原酶的辅酶，也是被称为一种新的维生素，具有多种生理功能，在防治肝损伤和肝中毒、促进神经生长因子生成、调节自由基水平，抗辐射损伤、心血管疾病和糖尿病等方面有重要医用价值。

目前PQQ主要是化学合成法，微生物合成具有清洁低碳、温和可控、成本低廉等优势，是一种极具潜力的生产方式。影响微生物发酵生产PQQ大规模应用的主要因素有：（1）适合于工业生产的微生物不多；（2）文献报道的PQQ生产菌株生产周期长，产率不高；（3）PQQ作为一种辅酶，并不是微生物的次级代谢产物，其合成调控受培养条件和代谢调控的严格制约。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种能使PQQ合成量增加的培养方法和发酵培养基，摸索一条行之有效的微生物发酵生产PQQ的控制方法，实现利用甲基营养菌高效生产PQQ的目的。

本发明的另一目的是提供一种发酵制备所述PQQ的发酵培养基。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法，其包括如下步骤：

（1）活化菌种：将原始菌种甲基营养菌Methylovorus sp.MP688接种到固体培养基中，在适合原始菌种生长的条件下进行培养，得活化的菌种；

（2）种子液的培养：将步骤（1）所得活化好的菌种接种到液体培养基中，在适合菌体生长的条件下进行培养，得种子培养液；

（3）发酵罐发酵：将步骤（2）所得种子培养液按比例接种到含有发酵培养基的发酵罐中；发酵培养过程中温度恒定，同时，发酵罐的pH、溶解氧和搅拌转速采用两阶段控制策略；氮源补料采用pH-氮源联控方式进行，碳源补料采用间歇补料方式进行；

（4）收获发酵液，得吡咯喹啉醌。

进一步地，本发明提供了以下优选的技术方案：

其中，所述甲基营养菌Methylovorus sp.MP688，已于2010年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.4096。（详细信息请参见中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所申请的专利号为201010548511.9的发明专利）。

优选的，步骤（1）中所述培养温度为30～35℃，培养时间为2～3天；所述固体培养基为在基本培养基的基础上添加琼脂粉和碳源甲醇，所述琼脂粉在所述固定培养基中的浓度为1～2g/L，所述甲醇在所述固定培养基中的浓度为7.5～15g/L，其中，所述基本培养基的组分及配比如下：

基本培养基（以1L计）

MgSO₄·7H₂O        0.4-1g，

(NH₄)₂SO₄          3-5g，

KH₂PO₄             1.4g，

Na₂HPO₄·12H₂O     3g，

柠檬酸铁           10-30mg，

CaCl₂              10-30mg，

MnCl₂·4H₂O        5-10mg，

ZnSO₄·7H₂O        5-10mg，

CuSO₄·5H₂O        0.5-2mg，

叶酸               0.02-0.05mg，

生物素             0.02-0.05mg，

核黄素    0.02-0.05mg，

烟酸      0.02-0.05mg，

硫辛酸    0.02-0.05mg。