[发明专利]重组鸡干扰素α制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，特别是涉及一种重组鸡干扰素α（Recombinant chicken interferon α，rChIFNα）的制备方法。

背景技术

随着近年来全球畜禽养殖业的迅猛发展，我国养鸡业已由农村家庭副业发展成了社会一大产业，无论是禽类的品种还是数量都位于世界前列。然而，养禽业还存在很多问题，如禽流感、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、马立克氏病和鸡新城疫等传染性疾病，每年都会在不同的季节暴发，这些动物一旦感染发病，则初发病急、临床症状严重、极易传播扩散以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；更为重要的是，鸡与人类密切接触，某些病毒性传染病如禽流感等还给人类健康带来潜在威胁。目前禽类传染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，常导致疫苗免疫失败。一些病毒病目前尚无疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人类的健康。

常用的药物治疗主要采用抗生素进行治疗，但是近年来由于抗生素的广泛和大量使用，导致耐药性菌株大量产生，并通过食物链传染给人，给人类健康带来更大的威胁。现在一些国家己明令禁止一些抗生素和抗菌剂在养殖业中的应用。因此，使用干扰素来积极治疗和预防家禽、家畜的病毒性疾病将是人类最为关注的问题。

IFN是一类由病毒及脂多糖等物质诱导机体产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白质，1957年由Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三种型。现已知，干扰素α在体内可有选择性地作用于病毒感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用，但对正常宿主细胞无作用。但目前重组鸡干扰素α未见报导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组鸡干扰素α的制备方法，所述的干扰素用于α治疗鸡新城疫(ND)、禽流感、马克立氏病(MD)。

本发明的制备方法为：通过设计引物，从鸡肝脏组织中提取RNA进行RT-PCR反应，并将扩增出的鸡干扰素α基因克隆于T载体后再连接至原核表达载体pET-32a中，以大肠埃希菌BL21(DE3)作为原核表达的宿主菌，构建成BL21/pET-32a-rChIFNα工程菌，并在通过PCR、双酶切鉴定后用IPTG诱导其表达鸡干扰素α，经纯化后除菌、分装和冻干，制成冻干粉针剂。

本发明制备的重组鸡干扰素α的冻干粉针剂，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，规格为：IFN含量≥2万单位/瓶，2～8℃可长期保存，室温（≤25℃）可保存两年。使用时轻轻摇匀后即可进行滴鼻接种，仔鸡500 IU/只/天；成年鸡2000～10000 IU /只/天，每日一次，一个疗程3～5次。在治疗已发病鸡的同时，应及时隔离未发病鸡，并给予等量相应药物预防

本发明与现有技术相比，所制的重组鸡干扰素α是一类能诱导鸡细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，能够用于鸡新城疫、禽流感病毒性疾病的防治。 

附图说明

图1 为鸡干扰素α基因RT-PCR扩增的结果。

在图1中，1：DNA Marker DL2000，2：RT-PCR扩增产物在502bp出现单一条带；

图2为重组质粒pMD18-T/ChIFN-α 双酶切鉴定结果；

在图2中，1为DNA Marker DL2000，3、4为重组质粒pMD18-T/ChIFNα 经EcoR I和HindⅢ双酶切结果，在502bp处出现单一条带。

图3重组质粒pMD18-T/ChIFN-α PCR结果。

在图3中，5为以重组质粒pMD18-T/ChIFNα为模板PCR产物在502bp处有单一条带。

图4为重组质粒pET32/ChIFN-α双酶切鉴定结果。

在图4中，6、7为重组质粒pET-32a-rChIFNαEcoR I 和HindⅢ酶切鉴定结果，8为pET32空质粒。

图5为重组质粒pET32/ChIFN-α的PCR结果。

在图5中，9为：阴性对照，10、11为以重组质粒pET-32a-rChIFNα模板PCR扩增产物。

图6为0.5mmol/L IPTG 32℃诱导的重组鸡干扰素α蛋白SDS-PAGE电泳检测结果 。