[发明专利]重组鸡干扰素α制备方法

权利要求书

1.重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：a、鸡干扰素α基因的获取;b、构建克隆载体;c、 构建表达载体;d、重组蛋白的表达;e、重组鸡干扰素α 粗制品的制备;f、重组鸡干扰素α粗制品纯化。

2.根据权利要求1所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：所述的

鸡干扰素α目的基因为： 

gaattcgcct gcaaccacct tcgcccccag gatgccacct tctctcacga cagcctccag    60

ctcctccggg acatggctcc cacactaccc cagctgtgcc cacagcacaa cgcgtcttgc   120

tccttcaacg acaccatcct ggacaccagc aacacccggc aagccgacaa aaccacccac   180

gacatccttc agcacctctt cacaatcctc agcagcccca gcactccagc ccactggaac   240

gacagccaac gccaaagcct cctcaaccgg atccaccgct acacccagca cctcgagcaa   300

tgcttggaca gcagcgacac gcgctcccgg acgcgatggc ctcgcaactt cacctcacca   360

tcaaaaaaca cttcagctgc ctccacacct tcctccaaga caacgattac agcgcctgcg   420

cctgggaaca cgtccgcctg caagctcgtg cctggttcct gcacatccac aacctcacag   480

gcaacacgcg cactaagctt gc                                         502。

3.根据权利要求1所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：

所述的a、鸡干扰素α基因的获取：

采用TAKARA公司RNA提取试剂盒从鸡肝脏组织中提取RNA，并利用引物进行RT-PCR反应；

引物序列：上游：CCG GAATTC GCCTGC AACCAC CTTCGC

下游：CCG AAGCTT AGTGCG CGTGTT GCCTGT

引物分别带有EcoRⅠ和HindIII酶切位点； 

提取RNA反应条件：在25μL的总反应体系中，基因组DNA 1.5 μl，上下游引物各0.5 μl，PCR Mix 为12.5 μl，加无菌水至25 μl；

RT-PCR反应条件：95℃预变性4 min；94℃ 变性45 S，58℃ 退火45S，72℃ 延伸1 min，循环35次，最后72度延伸10 min，RT-PCR产物通过胶回收试剂盒回收。

4.根据权利要求1所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：

所述的b、构建克隆载体：

PCR扩增鸡干扰素α目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。

5.根据权利要求1所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：

所述的c、 构建表达载体：

选择目的基因经测序后与Genebank一致的克隆载体进行双酶切后与分别与表达载体pET-32a进行连接，并转化至BL21大肠杆菌，分别涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功。

6.根据权利要求1所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：

所述的d、重组蛋白的表达： 

分别挑取与pET-32a表达载体连接的重组表达菌于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中扩增，测OD值在0.6～0.8时，加入IPTG，32℃诱导表达（终浓度100μg/ml）5h，收集细菌。