[发明专利]一种Barnase基因定量PCR检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及转基因检测技术领域，尤其涉及一种Barnase基因定量PCR检测方法及其应用。        

背景技术

    随着转基因植物种植面积的增长和全球公众对于转基因植物及其产品安全性的关注和忧虑，全球已有50多个国家颁布并实施了转基因生物标识制度。为确保转基因生物标识制度的顺利实施，转基因生物及其产品检测方法的研究十分重要。

在转基因产品检测过程中，PCR技术因其灵敏度高、重现性好等特性，应用最为广泛。以PCR技术为基础的转基因检测，根据其检测特异性的高低分为筛选、基因特异性、构建特异性和转化体特异性检测四个层次。其中转化体特异性检测方法特异性最高，目前我国已经针对批准进口和在国内取得安全证书的转基因品种建立了完善的转化体特异性检测标准体系。但在检测工作中，只采用转化体特异性检测方法进行检测非常耗时耗力。为了提高检测效率，通常先采用筛选或基因特异性检测方法对样品进行初步的筛查检测，然后有针对性地采用转化体特异性检测方法对样品进行身份鉴定。因此，以转基因品种中的目的基因为检测靶标建立基因特异性检测方法，将会大大节省检测时间并且提高其工作效率。

Barnase是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）产生的一种胞外RNA酶（核糖核酸）。在转基因植物领域，Barnase基因最为重要和最为成功的应用还是通过控制其在花粉绒毡层中的特异表达抑制花粉的发育，而获得转基因植物雄性不育系。目前，含有Barnase基因的转基因作物已经在多个国家被批准商业化种植和销售，如商业化的转基因杂交油菜杂交品种MS1※RF1、MS1※RF2和MS8※RF3。国内的一些研发者将Barnase基因转化到其它植物中，获得了育性改变的转基因植物。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于Barnase基因特异性定量PCR（聚合酶链式反应）检测方法的报道。以Barnase基因作为检测靶标，建立特异性强、灵敏度高的Barnase基因定量PCR检测方法迫在眉睫，以便为我国转barnase基因植物及其产品监管服务。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术在商业化及未商业化的含有Barnase基因的转基因作物及其衍生品种安全评估及检测工作中存在的不足，提供一种Barnase基因定量PCR检测方法及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

根据转基因油菜MS1、MS8中Barnase基因序列特征设计引物探针，筛选出特异性强、灵敏度高和重现性好的Barnase基因定量PCR检测方法。

一、一种Barnase基因定量PCR检测方法(简称检测方法) 

①检索分析Barnase基因序列

将NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索的Barnase基因序列(Genbank Accession No. M14442.1)与转基因油菜MS1、MS8中的进行比对，确定了Barnase基因的检测靶标，其序列特征是：SEQ NO.1；

②利用该序列特征设计Barnase基因特异性定量PCR检测的引物和探针

合成引物序列如下：qBarnaseF：5’AATCAGAAGCACAAGCCCTCG 3’和qBarnaseR：5’AGTTTGCCTTCCCTGTTTGAGAA 3’；

合成TaqMan探针序列如下：qBarnaseP：5’FAM－TGTCTCCGCCGATGCTTTTCCCCG－TAMRA 3’；

③建立标准曲线

提取样品总DNA，分别利用上述引物qBarnaseF/qBarnaseR和探针qBarnaseP组合进行实时荧光定量PCR扩增；转基因油菜MS1基因组DNA被相同浓度非转基因油菜基因组DNA稀释至不同含量，分别以100、20、4，0.8、0.016ng MS1基因组DNA的混和DNA样品，进行荧光定量PCR反应并建立标准曲线；

④定量体系的精确性验证

以标准曲线为参照测定含有MS1基因组DNA的混和油菜基因组DNA样品中Barnase基因的量。

二、一种Barnase基因定量PCR检测方法的应用

应用于转基因植物及其产品中Barnase基因的检测，为转基因安全监管提供一定技术支撑。

利用上述检测方法分别检测质量百分比分别为1%和2%的MS1油菜籽加工产品混样。