[发明专利]一株腐皮镰刀菌菌株及发酵生产大黄酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于药用微生物技术领域，具体涉及到从药用植物掌叶大黄中分离出的一株内生真菌腐皮镰刀菌R13(Fusarium solani R13)，该菌株通过液体发酵能产生大黄酸和大黄素，可用于大量生产大黄酸或其类似物。 

背景技术

大黄是蓼科大黄属植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Baill)的干燥根及根茎，又名将军，具泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经的功效，是临床最常用的药物之一。它的活性成分大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等具有具抗菌、抗肿瘤、抗病毒、保肝、强心、延缓衰老、调节免疫功能等作用。 

随着大黄中有效成分的分离纯化以及色谱技术的广泛应用，从上世纪80年代开始大黄中单体的研究。例如大黄酸(Rhein,4,5-dihydroxyanthraquinone)属单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物，是掌叶大黄、虎仗等多种传统中药的主要有效成分之一。近年来发现大黄酸具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、保肝抗纤维化、抗突变、抗多药耐药和联合用药、改变肾脏基因表达谱、改善细胞代谢、调脂作用等药理学作用。大黄素具有诸多抗炎、抗病毒、抑菌、免疫调节、保护肝肾、促进胃肠蠕动、抗氧化、清除自由基、改善微循环等药理学作用。大黄已广泛应用于临床，如用于黄疸、急性胰腺炎等的治疗，大黄酸的1,8-二乙酰化物(Diacerein)已用于治疗骨关节炎，其有效物质形式应为大黄酸。 

大黄酸已经从传统的泻药成分转变成为一种具有广泛生理作用的新型药物单体。经过结构修饰制备大黄酸偶联物以及衍生物，可改善大黄酸溶解性。利用大黄酸的骨趋向性作为药物骨靶向制剂载体，研制高效低毒的新型抗肿瘤药也日益成为关注的重点。随着大黄酸药物单体需求研究，单体大黄酸生产愈发重要。 

内生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物组织内部，但不引起植物病害的真菌，在植物组织中普遍存在。内生真菌与宿主在长期的生态系统演化中形成了互惠共生关系，可产生与宿主相同或不同的具有生物活性的次生代谢产物。1993年，Strobel从短叶红豆杉中分离到一株能够产生紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae)，这为抗肿瘤药物的研究增添了新的途径。一系列的科学研究表明，植物内生真菌既能够产生与宿主植物相同或相似的 有效活性物质，也能够产生其他有活性的天然产物。内生真菌的天然产物种类十分丰富，几乎涵盖了所有的天然产物的类型，因此内生真菌为天然产物的发现提供了广泛的资源。 

发明内容

本发明涉及一种从掌叶大黄(Rheum Palmatum L.)中分离出的一株产大黄酸的内生真菌。该内生真菌经形态学和rDNA ITS序列分析鉴定是腐皮镰刀菌属(Fusarium solani)，是一种丝状真菌。可用于大量生产大黄酸或其类似物。 

本发明的技术方案。 

本发明采用严格的表面灭菌方法，从植物掌叶大黄活体植物中分离得到植物内生真菌R13，经rDNA ITS序列分析，即核糖rDNA内部转录间隔区(Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer)序列分析技术，结合微生物学形态学鉴定证明该菌株属于腐皮镰刀菌属(Fusarium solani)。该菌株已于2013年1月9日送交保藏湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:M2013009。 

本发明所述的腐皮镰刀菌R13菌株的分离及筛选流程。 

首先，从中国四川省若尔盖草原采集掌叶大黄活体植株，选择健康完好的植物进行表面清洗和消毒，在无菌的环境下，对根、茎、叶和花进行切段，接着放入马铃薯葡萄糖培养基(PDA)培养皿中，于培养箱中培养，观察菌落生长情况，一般5-10天可看到切段周围有丝状真菌长出；对长出的真菌进行分离纯化后保种并进行液体发酵培养，提取菌丝体中的蒽醌，以标准品大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照，进行高效液相色谱(HPLC)检测，根据色谱图筛选产大黄酸的菌株；对初筛菌株进行高效液相色谱质谱连用(LC-MS)分析，进一步的确定产大黄酸的能力，对分析后确定产大黄酸的菌株进行系统分类学研究，包括形态学和分子生物学水平鉴定。 

菌株分类学地位的鉴定。 

1.固体培养特征。