[发明专利]一种猪水疱病检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原微生物检测用试剂盒，属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于猪水疱病检测的试剂盒。

背景技术

猪水疱病(Swine vesicular disease,SVD)是由小RNA病毒科( Picornaviridae) 肠道病毒属( Enterovi rus)猪水疱病病毒（SVDV）引起的一种急性接触性传染病。本病于1966 年首先发现于意大利的一个猪场,随后在欧洲的许多国家相继发生流行蔓延,引起严重的经济损失并导致世界肉类市场的混乱,因而本病受到极大关注，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国农业部将其列为一类动物疾病。快速和可靠的诊断对于猪水疱病的控制和消灭至关重要，而且对肉食品中低含量的猪水疱病病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法，必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高,不能满足快速、准确诊断的要求。现有的RT-PCR、竞争PCR 和ELISA-PCR 方法克服了这些方法的不足，可用于猪水疱病的诊断，但也有费时、易污染和每次检测的样品数量少等缺点。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的用于检测猪水疱病的试剂盒。

本发明的猪水疱病检测试剂盒中包括两对引物，分别是上游外引物SEQ № 1，下游外引物SEQ № 2，上游内引物SEQ №3和下游内引物SEQ №4。

根据相关实验，本发明的猪水疱病检测试剂盒内放置的外引物与内引物的最佳比例为外引物︰内引物等于1︰8。

为方便本发明的试剂盒的使用，本发明的猪水疱病检测试剂盒内还有10×LAMP反应缓冲液、一对外引物和一对内引物、Bst DNA聚合酶、AMV 反转录酶、dNTPs、硫酸镁（MgS0₄）、甜菜碱（Betaine）和灭菌双蒸水。

本发明工作原理是：反转录环介导等温扩增反应过程是在60～65℃左右对RNA进行同步反转录和等温扩增，由外引物扩增出内引物扩增所需要的模板即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因的DNA片段，由于内引物扩增的DNA片段含有该引物5′端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，由于扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。

反转录环介导等温扩增（reverse transcription loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP)是一种新型的RNA扩增技术，与现有的核酸扩增方法相比有其独特的优点：反应过程中不需经普通PCR的变性、复性和延伸，可在恒温条件下1小时内高效率地扩增目的基因；不需要特殊的仪器设备，适于基层兽医站、养殖场户及进出口检疫等部门的使用和推广；扩增主要依赖针对靶基因6个特定区域的4条特异性引物，特异性高。RT-LAMP快速诊断方法能够克服目前检测方法中存在的耗时长、操作繁琐、敏感性差及假阴性等不足，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、省时等优点。利用这种检测方法可以对肉制品，隐性感染或持续带毒动物组织样品中的低含量猪水疱病病毒进行快速、准确检测和对发病动物进行早期快速鉴别诊断。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:

1、本发明利用Bst DNA聚合酶的链置换特性，设计4特异条引物，识别靶序列的6个特定区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在检测时不需要任何特殊设备。

2、本发明的敏感性高于普通RT-PCR技术。

3、本发明由于不需经过RT-PCR技术的3个温度的重复循环，检测时间比RT-PCR短，一小时内即可完成。

4、本发明的反应温度在60～65℃左右，且识别靶基因6个特定区域，引物多聚体及非特异性扩增几率大大降低，特异性大大提高。

附图说明    

图1是本发明中温度优化结果的电泳图，图中1–6泳道分别代表的反应温度为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃ 和65℃，由图示结果确定扩增最佳温度为62℃。