[发明专利]大肠杆菌来源的PCV2 ORF2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型衣壳蛋白基因及载体、菌株及其表达方法，和含该病毒样颗粒的疫苗及其在预防断奶仔猪多系统衰竭综合征(特别是PCV2）感染的用途。

背景技术

猪圆环病毒PCV属圆环病毒科，圆环病毒属，为无包膜的单链环状DNA病毒。此病毒在世界各国广泛流行，该病毒不仅造成猪仔生长缓慢，同时会侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，引起机体的免疫抑制，给世界养猪业造成了很大的经济损失。

基因组非常小，根据基因组成及抗原性的不同，PCV可以分为两种血清型，PCV1型和PCV2型；其中PCV1 基因组全长为1759bp，PCV2 为1767 bp或1768bp。约有11个开放框，即ORF1-ORF11，分别编码1.8~ 35.8 kD的蛋白质，其中ORF1、ORF5、ORF7 和ORF10 在编码链上，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9 和ORF11 在互补链上。ORF1、ORF2、ORF3为三个主要的开放阅读框。ORF1编码与病毒复制相关的酶蛋白，通过剪切策略，编码长度大小分为Rep和Rep’，Rep和Rep’催化病毒DNA的复制。其中Rep和Rep’可以形成同源二聚体（Rep-Rep）和异源二聚体（Rep’-Rep’），同源和异源二聚体比例在病毒复制的不同阶段也在变化，分别发挥不同的作用。ORF2编码病毒的衣壳蛋白，是病毒的主要结构蛋白，在适当的条件下，ORF2蛋白可以自组装成病毒样颗粒（virus-like-particles，VLPs），VLPs不仅与病毒粒子具有相似的外形，而且不含有核酸，是预防性疫苗研发的靶位点。ORF3编码一种小蛋白，与PCV2诱导的细胞凋亡有关，其他的ORF功能尚不清楚。

调查显示，1997-2003年间，中国猪场中以PCV2a占主导，而自2004年后，PCV2b则越来越普遍。分子流行病学调查结果显示，PCV2b在中国的流行范围最广，所占比例最大，而且PCV2b的毒性更强，市场需求尽快研发相关疫苗，预防圆环病毒的感染。

目前市场上的猪圆环病毒疫苗的制作采用了全病毒灭活技术、病毒嵌合技术和病毒亚单位疫苗技术。目前国内注册的国产圆环病毒均为全病毒灭活疫苗，PCV在细胞内的增值滴度很低，而且灭活疫苗对机体的刺激时间较短，需要多次接种才能达到一定的保护效果。由于PCV2难培养、生长慢及难灭活，培养成本高，生产周期长等特点，全病毒灭活存在一系列的问题，最重要的是在灭活过程中灭活效果的检测是一大关键，此外，在灭活过程中对病毒的表面中和表位的破坏也是一大问题，造成灭活疫苗的保护性效果很差。全病毒培养、灭活是一项经典技术，不是未来研制的发展方向。分子生物学技术越来越多的应用于疫苗的研制。病毒样颗粒组装技术已经成功并广泛的运用于现代疫苗研发与生产。

目前认为引起PCV感染的原因主要有以下四点：病毒毒力、宿主易感性、并发感染以及免疫激发。其中，尤其要指出的是病毒感染后会造成机体的免疫抑制，降低机体的免疫能力，形成并发感染。

目前，已上市的PCV疫苗除了灭活苗外，基因工程疫苗均采用真核表达系统。由于PCV-2难培养、生长慢，考虑到病毒培养成本高、周期长，故而灭活苗存在一系列的问题。基因工程疫苗有Merck的Circumvent-PCVM、勃林格的CircoFlex等。这些疫苗均采用昆虫杆状病毒表达PCV2衣壳蛋白，再将其制备成疫苗，上市的疫苗的均被证实具有良好的免疫效果，但是高昂的售价成为了制约上述产品在广大发展中国家推广的瓶颈。

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一。由于该表达系统具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高的显著特点，因此被广泛应用生物制药行业中。糖基化修饰是真核表达系统和原核表达系统的主要区别之一，但是PCV2的ORF2并不含有糖基化位点，两种系统之间在糖基化修饰方面并没有区别。此前也有众多的研究者尝试利用大肠杆菌表达系统进行PCV-ORF2蛋白的表达，进而进行PCV预防性疫苗的开发。但是众多的研究结果均表明，ORF2N端含有由41个氨基酸组成的核定位信号，这个信号肽由于密码子偏嗜性的原因，致使ORF2蛋白在E.coli中的表达量非常低，失去了大规模商业应用的可能，本发明因此而来。

发明内容