[发明专利]具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和产生乙醇的发酵方法。具体来说，本发明提供具有高木糖消耗率的酵母属(Saccharomyces)菌株。 

背景技术

过去数十年间对传统石化燃料(以石油为主的燃料)的大规模消费已付出了很高的代价并造成大量污染。而且，人们已认识到世界石油储量并非无穷无尽，且随着环境意识逐渐成长，已刺激人们开始研究替代性燃料的可行性，例如纤维乙醇，其可降低CO₂产生。 

目前用于产生乙醇的方法包括以下操作阶段：(a)使适当原材料发酵以获得发酵产物和(b)蒸馏通过发酵获得的产物，藉此产生乙醇。目前主要使用属于酵母属的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为乙醇发酵的种菌。酿酒酵母细胞为圆形到卵形，直径为5–10微米且可有效利用己糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖等。上文所提及的发酵方法包括在含有氮源、碳源和微量元素等的培养基中接种酿酒酵母且在适当条件下执行发酵，且其涉及化学反应：C₆H₁₂O₆→2CH₃CH₂OH+2CO₂。 

可使用各种生质原料进行酒精生产。用于通过发酵制造乙醇的多种多样的原材料可方便地分类为三种类型的农业原材料：糖、淀粉和木质纤维素材料。尽管生质乙醇可通过多种不同来源获得的糖或淀粉发酵来产生，但迄今为止，用于工业规模生产燃料酒精的底物是蔗糖和玉米淀粉。使用糖或淀粉来生产乙醇的技术已发展成熟；然而，所述底物成本高，其可能与食品供应竞争且从所述来源生产乙醇不足以满足未来对燃料工业的需求。因此，业内对从木质纤维素生产乙醇的兴趣逐渐增加。由于木质纤维素可再生，资源丰富，不与食品供应竞争且可以相对较低的成本获得，所以木质纤维素是诸如玉米粒等其它乙醇原料的合意替代品。扩大燃料乙醇生产要求能使用较低成本的原料。目前，只有木质纤维素原料可从植物生物质获得足够数量来代替用于生产乙醇的作物。木质纤 维素材料中的主要可发酵糖是葡萄糖和木糖，其分别占木质纤维素的约40%和25%。 

然而，大多数能进行酒精发酵的酵母(如酿酒酵母)不能使用木糖作为碳源。工业为了能从木质纤维素水解产物生产乙醇，需要具有这些特性的生物体。科学家利用遗传技术或菌株驯化来改良用于产生乙醇的酵母或细菌的木糖发酵。US5789210提供能有效使单独的木糖发酵或同时使木糖与葡萄糖发酵的酵母菌株，其可使用重组DNA和基因克隆技术来产生，且所述技术已用于产生含有克隆木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XD)和木酮糖激酶(XK)基因的重组酵母，所述基因与不受葡萄糖的存在抑制的启动子融合。US6582944涉及经木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶基因转化的新颖重组酵母菌株，其能将木糖还原为木糖醇并因此能在活体内产生木糖醇。伯恩(Bjorn)等人提供酵母菌株TMB3001，其通过用木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶基因转化来解决不能代谢木糖以产生乙醇的问题(伯恩J(Biorn J)、巴贝HH(Barbel HH).非氧化性磷酸戊糖途径控制木糖的发酵速率但不控制TMB3001中的木糖(The non-oxidative pentose phosphate pathway controls the fermentation rate of xylose but not of xylose in TMB3001),2002,欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS Yeast Research)2:227-282)。然而，其仍具有以下问题：木糖消耗率低(0.13g木糖/g生物质/小时)和乙醇产率低(0.15g产物/g所消耗木糖)。为解决这些问题，约翰松(Johansson)等人另外将转醛醇酶基因转化到酿酒酵母中以获得新菌株TMB3026，其可将木糖消耗率从0.12提高到0.23。(伯恩J,巴贝HH.非氧化性磷酸戊糖途径控制木糖的发酵速率但不控制TMB3001中的木糖,2002,欧洲微生物学会联合会酵母研究2:227-282)；然而，仍未满足对工业生产的要求。凯撒(Kaisa)等人另外产生经转化酵母TMB3057，其改良木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶以及缺失的醛糖还原酶基因(GR3)的基因表达，从而提高乙醇产率并降低木糖醇副产物的形成(凯撒K、罗曼F(Romain F)、巴贝HH、玛丽GG(Marie GG).木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的高活性通过重组酿酒酵母改良木糖发酵(High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improves xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae),2007,应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.73:1039-1046))。然而，此菌株仍具有木糖消耗率低(0.25g木糖/g生物质/小时)和乙醇产率低(0.27g产物/g所消耗木糖)的问题。此外，伊丽莎白(Elizebath)等人使用基因经修饰的酵母424A(LNH-ST)，其经粗糙链孢霉(N.crassa)和近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)的木糖还原酶基因以及树干毕赤酵母(P.stipitis)的木糖醇脱氢酶基因转化且具有三个氨基酸的优化密码子(伊丽莎白C、米洛斯拉夫S.(Miroslav S.)、南希W YH(Nancy W YH)、内森SM(Nathan SM)，乙酸和pH对葡萄糖与木糖通过遗传改造的酿酒酵母菌株共发酵为乙醇的效应(Effect of acetic acid and pH on the  cofermentation of glucose and xylose to ethanol by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae),2010,欧洲微生物学会联合会酵母研究10:385-393)。此菌株也利用GAPDH启动子来控制TKL1、TAL1、RKL1和RPE1的磷酸戊糖途径。然而，其仍具有以下问题：木糖消耗率低(在pH5下0.27g木糖/g生物质/小时)和乙醇产率低(0.785g产物/g所消耗木糖)和对乙酸的耐受性低(在培养基含有1g/L乙酸时，木糖消耗率从0.354降低到015)。