[发明专利]辅酶Q10高产菌株选育快速筛选的方法

说明书

技术领域

本发明涉及辅酶Q₁₀，尤其是涉及一种辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法。

背景技术

辅酶Q₁₀是人类生命中不可缺少的重要元素之一。它是一种能激活人体细胞的能量、提高人体免疫力、增强细胞抗氧化能力和延缓衰老的重要生理活性物质，已经成为世界生物医药领域研究的热点。近年来广泛应用在保健品、化妆品和食品行业中。随着辅酶Q₁₀需求的日益增长，各国学者都纷纷聚焦在辅酶Q₁₀的生产研究。目前的生产方法主要包括直接提取法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法最具有发展前途，是最可能实现工业化生产规模的生产方法。

菌种筛选是提高菌种质量和稳定发酵水平的重要手段。由于菌株选育要经过初筛和复筛两个阶段，初筛的单菌落众多，一般在500～1000个，如果采用比较繁琐的测定方法势必影响菌株筛选的效率。辅酶Q₁₀通常采用常规紫外分光光度法和高效液相色谱法进行检测，这两种检测方法的缺点是：（1）常规的紫外分光度法因核酸和蛋白质等杂质的影响造成测定结果偏高，误差大；（2）高效液相色谱法工序复杂耗时，无法测定大量样品，效率较低，从而影响整体育种周期。

《⁶⁰Coγ射线对辅酶Q₁₀产生菌三孢布拉氏霉的诱变选育》（《西北农林科技大学学报》第34卷第4期）公开了一种辅酶Q₁₀产生菌三孢布拉氏霉的诱变选育方法，其筛选测定采用的方法是紫外分光光度法，通过蒸馏回流、石油醚萃取减压浓缩，然后用薄层层析分离浓缩液中的辅酶Q10，并采用紫外分光光度法测定辅酶Q₁₀的含量。该方法虽然测定结果准确，但是辅酶Q₁₀样品处理步骤繁琐，处理大批量的样品费时费力，筛选的效率较低，其中薄层层析其色泽深浅与样品质量浓度呈正相关，只能半定量测定比较各突变菌株相对产量。

《发酵菌体中辅酶Q₁₀的提取及其测定方法》（《无锡轻工大学学报》第22卷第2期）公开了一种提取及测定发酵菌体中辅酶Q₁₀的方法，该方法采用皂化提取纯度较高的辅酶Q₁₀，通过紫外分光光度法测定具有很好的重现性和稳定性，但其提取步骤繁琐，处理大量样品耗时耗力，从而筛选的效率较低。

《利用空间诱变选育辅酶Q₁₀高产菌》（《科技导报》第24卷第14期）公开了采用卫星空间育种获得诱变菌株，通过菌体大小和颜色作为初筛的主要标准，发酵液用石油醚等溶剂萃取辅酶Q₁₀，然后通过旋转蒸发仪获得辅酶Q₁₀样品，提取耗时近2h，辅酶Q₁₀样品采用HPLC检测。该方法能通过颜色和菌体大小对诱变菌体进行快速的初筛，但肉眼分辨有局限性，往往会遗漏一些高产菌株，其提取和检测方法都比较的耗时，影响整体的筛选效率。

本申请人在中国专利CN102154182A中公开一种辅酶Q₁₀生产的固料母种发酵培养的方法。采用的菌种为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides（保藏号CGMCCNo.4497）。采用斜面菌种传代，斜面培养基培养；将固料培养基蒸煮后晾干，分装灭菌，所述固料培养基包含固料组分与液体组分；将新鲜斜面菌种类球红细菌Rhodobacter sphaeroides加无菌水制成菌悬液，倒入固料培养基，培养后作为一级发酵的母种。在种子工艺中使用，有效提高辅酶Q₁₀发酵水平，节省发酵级数缩短了周期，简化生产环节，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于针对现有辅酶Q₁₀菌株选育筛选方法的不足，提供一种辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法。

本发明包括以下步骤：

1）从发酵液中超声波提取辅酶Q₁₀样品；

2）通过酶标仪初筛高含量辅酶Q₁₀菌株；

3）HPLC复筛。