[发明专利]辅酶Q10高产菌株选育快速筛选的方法

权利要求书

1.辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）从发酵液中超声波提取辅酶Q₁₀样品；

2）通过酶标仪初筛高含量辅酶Q₁₀菌株；

3）HPLC复筛。

2.如权利要求1所述辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于在步骤1）中，所述从发酵液中超声波提取辅酶Q₁₀样品的方法为：取辅酶Q₁₀发酵液，辅酶Q₁₀发酵液与提取溶剂按体积比为1～2∶10混匀后进行超声波提取，所述提取溶剂为乙醇和丙酮的混合溶液，所述乙醇与丙酮的体积比可为（5～10）∶1，提取的温度为30～35℃，超声处理，震荡后，静置，再用滤膜过滤收集滤液，即得到氧化型辅酶Q₁₀样品。

3.如权利要求2所述辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于所述超声处理的时间为30～40min，所述滤膜采用0.22μm的滤膜。

4.如权利要求1所述辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于在步骤2）中，所述通过酶标仪初筛高含量辅酶Q₁₀菌株的方法为：吸取相同体积的氧化型辅酶Q₁₀样品于酶标板中，通过酶标仪测定氧化型辅酶Q₁₀样品在275nm波长下的吸光值，再加入还原剂溶液，震荡后，测定还原型辅酶Q₁₀在275nm波长下的吸光值，根据氧化型辅酶Q₁₀和还原型辅酶Q₁₀吸光值差值的大小，通过查询标准曲线判断辅酶Q₁₀浓度的大小。

5.如权利要求4所述辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于所述还原剂溶液选自硼氢化钠溶液、硼氢化钾溶液、氢化铝锂溶液、氯化亚锡溶液中的一种。

6.如权利要求4所述辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于所述标准曲线的制作方法为：吸取相同体积不同浓度梯度的氧化型辅酶Q₁₀标准品溶液于酶标板中，通过酶标仪测定其在275nm波长下的吸光值，然后加入还原剂，在275nm波长下测定其还原型的吸光值，以辅酶Q₁₀标准品的氧化型与还原型在275nm波长下的吸光度差值对氧化型辅酶Q₁₀标准品浓度做回归曲线，即得到标准曲线。

7.如权利要求6所述辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于所述还原剂选自硼氢化钠、硼氢化钾、氢化铝锂、氯化亚锡中的一种；所述还原剂的加入量是至少能使全部的辅酶Q₁₀还原，还原剂的加入量的确定方法为：吸取3mL浓度为80～150mg/L辅酶Q₁₀标准品溶液加入到石英比色皿中，然后分别加入不同剂量梯度的还原剂溶液，均匀振荡，无水乙醇作为对照，待气泡消失后测定275nm波长下吸光值，当辅酶Q₁₀渐渐被还原时，吸光值逐渐下降，当275nm波长下的吸光值不变时，说明添加的还原剂剂量足够使氧化型辅酶Q₁₀标准品被完全还原，更进一步，可通过HPLC法来验证辅酶Q₁₀是否已经完全还原。

8.如权利要求1所述辅酶Q₁₀高产菌株选育快速筛选的方法，其特征在于在步骤3）中，所述HPLC复筛的方法为：将初筛得到的吸光值差值大的辅酶Q₁₀样品用高效液相色谱法进行复测，最终筛选出辅酶Q₁₀高产菌株；HPLC色谱条件为：色谱柱为不锈钢柱Inertsil.ODS-SP、规格为4.6×100mm，直径为5μm，检测波长275nm，流动相为无水甲醇∶无水乙醇=65∶35（V/V），流速：1.1～1.3mL/min，柱温：35℃，进样量：20～25μL，洗脱时间：20min。