[发明专利]一种多效复合生防菌剂的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生防菌剂，特别是一种用于防治作物土传病害的多效复合生防菌剂的制备方法及其应用，所述的两菌株分别为木霉菌（Trichoderma viride）和枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。

背景技术

随着越来越多有毒化学农药被限制使用，世界各国都在加大生物农药的研发力度。木霉菌作为一类有重要生防价值的拮抗性真菌，早在20世纪30年代就已经发现对植物病原真菌有拮抗作用，其作用机制包括产生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、竞争作用等。木霉菌强烈的竞争及生存能力在抑制病原菌尤其是土传病害的过程中起着重要作用，是一种很有开发利用价值的生防菌。目前国际上已开发注册有很多木霉菌产品，但由于木霉菌的生防机理所决定的木霉菌只能定殖在植物根表，在施用方式上只能用于作物发病前的预防而一旦发病，病原菌进入植物体内仅靠木霉菌解决不了，尤其对土传类病害的生物防治更是如此，这也在很大程度上制约了木霉菌生物农药的规摸化生产与应用。

枯草芽孢杆菌的有关文献记载的是一类普遍存在于土壤中、植物体表和体内的微生物，具有抵抗高温、低温、干燥及营养缺乏等不良环境的优点，有些菌株可在植株体内传导定殖和发挥促生作用，主要抑菌机理是通过产生抗菌物质来抑制病原菌的生长，并能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，与寄主植物建立和谐共生关系。定殖于宿主体内的内生细菌，有充足的营养来源，不易受外界逆境因子影响，与其它根际、叶际生防菌相比，稳定的生存环境更利于其发挥生防的作用。

将具有不同生防机理的多种生防菌株复合使用可明显提高防治效果已得到证实。如酵母菌和细菌复合使用可有效防治蔬菜灰霉病、放线菌混合芽孢杆菌防治草莓黄萎病等。将根际定殖的木霉菌与维管束内定殖的内生细菌复配成多功能生物农药尚未见报道。

经本实验室多年试验研究发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 能抑制许多植物病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀灭病菌，对土壤真菌包括镰刀菌、腐霉菌、丝核菌等病原菌引起的多种作物枯萎病、猝倒病、立枯病等有控制作用。通过耐利福平枯草芽胞杆菌突变菌株标记回收和DAS-ELISA等方法对枯草芽胞杆菌在瓜类植株体内的定殖动态进行分析发现，枯草芽胞杆菌可在作物组织内定殖并具有系统运转能力，即随着植物的生长而在体内繁衍，其代谢产物对许多病菌孢子萌发和菌丝生长具有抑制作用，表明代谢产物中存在着抗生素类物质，其代谢物质具较强的热稳定性和酸碱稳定性及对紫外线较强的耐性。利用生防木霉菌与内生性枯草芽孢杆菌防治作物土传病害的不同作用方式及生防机理将两者协同施用，将成为提高作物土传病害防治效果的重要手段，可解决木霉菌生物防治作用不稳定之不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于防治农作物土传病害的多效生防菌剂制备方法及其应用，与其它发明不同的是，本制剂克服已有技术的不足，根据土传病害的发生特点，通过从作物根表分离出拮抗木霉菌及枯草芽胞杆菌-内生拮抗细菌，将其复配成微生物制剂。

本发明通过多年大量研究发现大多数拮抗木霉菌具有强烈的竞争生存能力及对土壤中病原菌的重寄生作用，而大多数拮抗枯草芽胞杆菌可在作物组织内定殖并具有系统运转能力，即随着植物的生长而在体内繁衍，其代谢产物对许多病菌孢子萌发和菌丝生长具有抑制作用，利用二者对作物不同生态位点作用方式同时施用具有协同增效作用，可使防治效果达75％以上，

本发明的目的是按如下内容实现的：

所采用的生防菌取自于作物根表的木霉菌和内生枯草芽胞杆菌为母菌剂，将其分别纯化后转移至PDA试管斜面内作母菌剂，在三角瓶内振荡培养为二级菌种，再通过液体发酵使其产生抗逆性木霉菌厚垣孢子和枯草芽胞杆菌孢子，将载有大量孢子的发酵产物与载体混合后制成多效复合生防制剂。

所述多效复合生防菌剂按如下方法制备而成：

A:斜面母菌种的制备：

取作物根表土壤10克，加无菌水稀释至1000毫升稀释液，将稀释液与PDA培养基按1∶9的重量比例混合后倒入培养皿内制成平板，26℃下培养48小时，经分离获得木霉菌；纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；

PDA培养基：马铃薯200克、葡萄糖20 克、琼脂20克、孟加拉红0.05克、硫酸链霉素0.03克、水1000毫升；