[发明专利]一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒。

背景技术

呋喃西林(Nitrofurazone)等硝基呋喃类抗生素因其广谱、高效、廉价等特点被广泛应用于家畜、家禽、水产、蜂等动物传染疾病的预防和治疗。氨基脲(SEM)是呋喃西林的代谢产物，它在此类药物中毒性最强，在动物源性食品中的残留可通过食物链传递给人类，长期摄入有致畸胎、致癌等副作用。美国、日本和欧盟目前已全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质。我国农业部文件农牧发[2002]1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的检出限为不得检出。

呋喃西林在动物体内很快代谢，其中常以检测其代谢产物作为残留标示，目前欧盟对硝基呋喃类代谢物的检测方法灵敏度规定为1ug/kg。已报道用于检测硝基呋喃类抗生素代谢物残留的方法主要有HPLC、LC-MS、LC-MS/MS和酶联免疫法(ELISA)等。

HPLC、LC-MS、LC-MS/MS等方法灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法，在我国LC-MS/MS技术更是被作为此类药物在动物源性食品中检测的国标法。然此类方法对仪器和操作人员要求都较高，一个样品检测要几百元，检测时间也很长，不能满足现场抽检的需求和推广应用。ELISA技术以其快速、灵敏、特异性高等特点已成为目前药品残留检测的有效方法之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、特异性、准确度、精确度且操作简单的酶联免疫吸附检测试剂盒，用于定量快速检测蜂蜜、各种水产畜禽组织生物样品中的呋喃西林代谢物，以及饲料中的原型药。

一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的试剂盒，该试剂盒包括：呋喃西林代谢物特异性抗体、酶标板、呋喃西林代谢物辣根过氧化物酶标记物、呋喃西林代谢物标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和样品稀释液。

所述的清洗液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。

所述的显色剂为过氧化氢；或者过氧化脲、邻苯二胺与稳定剂K按5∶5∶1(体积比)混合而成；或者过氧化脲、四甲基联苯胺与稳定剂K按5∶5∶1(体积比)混合而成；在4℃下可以稳定保存两年不变色。

所述的酶标物稀释液为含酶稳定剂AH和酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液。

所述的稳定剂K、含酶稳定剂AH和酶保护剂均购自美国International Diagostica System公司。

所述呋喃西林代谢物酶标记物为浓缩液，使用时用酶标物稀释液溶解为工作液即可直接使用。

所述的呋喃西林代谢物标准品用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)配置成浓度分别为0ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.45ng/mL、1.35ng/mL、4.05ng/mL的溶液。

所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。

所述的浓缩样品稀释液为含1％BSA的5倍浓缩磷酸盐缓冲液。

所述呋喃西林代谢物特异性抗体包被在酶标板上。

所述呋喃西林代谢物特异性抗体为动物抗呋喃西林代谢物的多克隆抗体，用呋喃西林代谢物与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物制得。

所述动物为兔、鼠或羊。

一种利用一步法酶联免疫技术快速检测呋喃西林的方法，按照如下步骤进行：

(1)样品前处理：对于肌肉、肝脏、鱼、虾的组织，供试样用均质器均质样本，取1.0±0.05g的均质物进行以下操作；对于蜂蜜样品直接称取1.0±0.05g的供试样进行以下操作；

(2)加入4mL蒸馏水，0.5mL1M盐酸和150μL50mM的4-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀30s，60℃水浴3h，每隔1h涡旋振荡一次；

(3)加入5mL0.1M磷酸氢二钾和0.4mL1M氢氧化钠溶液，混匀加入6mL乙酸乙酯，振荡1-40min，室温条件下，4000g离心10min，收集3mL上层液体至10mL玻璃试管，50～60℃水浴氮气吹干；