[发明专利]无抗多效价迟钝爱德华氏菌载体活疫苗、其制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及减毒突变株技术领域，特别涉及鱼用细菌性减毒活疫苗技术领域，具体是指一种迟钝爱德华氏菌疫苗株的重组无抗多效价疫苗载体、相关制剂及其应用。

背景技术

现代的水产养殖业在各个国家都呈现出大规模、集约化的发展趋势，它在为人类提供食物的环节中扮演着非常重要的角色。随着全球的人口在增长，人类对食物的需要量在不断的加大，当然对鱼类的需求量也在加大。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖产量及成长造成严重影响。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、爆发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30%以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。

疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Inactivated Vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，减毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。多效价载体疫苗是以减毒活疫苗为疫苗载体，通过将多种不同病原菌的抗原插入到同一个表达的质粒载体上，避免了减毒活疫苗存在的潜在的毒力返还风险，在宿主体内激发免疫反应时免疫应答效果更好，被广泛用于疫苗开发。

传统的载体疫苗都是通过质粒来表达异源抗原的，而通常质粒都是采用抗生素作为筛选标记的，这样对于疫苗存在两个主要的问题需要解决。当疫苗进入到宿主体内时，宿主体内是不存在抗生素的选择压力的，使用了高拷贝质粒的疫苗，因为没有选择压力的存在，会大量丢失质粒，使得异源抗原的表达量下降迅速，最终会导致疫苗效价降低。另外，疫苗构建过程中使用抗性选择基因使得后期疫苗的应用存在很大的潜在安全性问题。自然界中基因会发生漂移，抗性基因也不例外，因此目前人畜使用的疫苗对抗性基因的使用非常严格，虽然水产疫苗还没有相关的政策，但是水产养殖的鱼类做为人类的食物来源，安全性是值得重视的。

如果一个菌株因为自然突变或者是人工的方式变成了营养缺陷型，因为其染色体上的某个基因缺失后产生对某一种营养物质的依赖，那么这个缺失突变株可以通过一个有功能的、存在于质粒上的基因进行回补，这种回补就可以通过在培养基中添加这类营养物质来进行筛选而不是抗生素，如果培养基中不含有这种营养物质那么只有带有回补质粒的菌株才可以生长。同样，这种质粒在宿主体内也可以稳定的存在，因为质粒上的筛选压力来自于疫苗株的生存，而不是需要额外的合成抗生素等物质。通过这种染色体-质粒回补的形式构建的系统就被称为平衡致死系统。因为平衡致死系统可以替代抗性筛选标记而不需要再使用抗性筛选表达，将这种系统用于构建非抗性选择标记的疫苗，解决了抗性选择标记所带来的生物安全性问题。

爱德华氏菌属是导致淡水、海水养殖鱼类细菌性疾病的一类常见的病原体，具体分为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)和保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae)。由其引起的鱼类出血性败血症统称为爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)。该病传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高，危害的种类多，有鲤鱼，罗非鱼，鳗鲡，鲻鱼，鲑鱼，鳟鱼，鲆鲽等大多数具有较高经济价值的鱼种。此外，迟钝爱德华氏菌还感染贝类、爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类。值得注意，迟钝爱德华氏菌还是一种重要的人畜共患病原菌，它是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。目前，我国养殖鱼类爱德华氏菌病病害比较严重的病原体主要为迟钝爱德华氏菌，并有存在病原体向人体转移的巨大威胁。美国专利有利用利福平筛选得到野生毒株的自然减毒突变体作为减毒活疫苗的报道(Evans J J,Klesius,P H and Shoemaker C A2006Modified live Edwardsiella tarda vaccine for aquatic animals;United States Patent7067122)。目前在我国尚无该病害的有效防治措施。

发明内容