[发明专利]一种抗体检测试剂盒(OmpC-IgA)

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测抗大肠杆菌外膜孔道蛋白C IgA抗体的免疫分析检测试剂盒。

技术背景

大肠杆菌是人体肠道内的正常细菌之一，一般情况下不致病。但在某些特殊情况下，当机体对大肠杆菌的某种蛋白过激反应时，可发生腹痛、腹泻等肠炎症状。研究表明，一种病因复杂的非特异性炎症性肠病((Inflammatory Bowel Disease，IBD)与机体对大肠杆菌外膜孔道蛋白C的过激反应有关，大约有50％的IBD患者血清抗OmpC的IgA抗体比正常人高2倍以上，因此，通过检测血清中抗OmpC的IgA可以辅助诊断IBD。

现有检测OmpC抗原的双抗夹心法酶联免疫试剂盒，但没有检测OmpC抗体的酶联免疫检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便、灵敏、准确的检测OmpC抗体的免疫分析检测试剂盒，具体来说是检测人抗大肠杆菌OmpC-IgA抗体的免疫分析检测试剂盒。

本发明提供了一种检测OmpC-IgA抗体的免疫分析检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有OmpC的微孔板、酶标记抗人IgA抗体、阴性对照品、阳性对照品、显色剂、洗涤液。其中包被微孔板的OmpC是用重组的蛋白或者从大肠杆菌纯化所得的蛋白。所述的酶标记抗人IgA抗体采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述偶联方法为戊二醛法。

用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。

所述的洗涤液为0.05％-0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1∶1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐或碳酸盐缓冲液，所述的抗体稀释也为含0.1％吐温-20的磷酸盐或碳酸盐缓冲液。

本发明的另一方面，提供了一种检测血清中抗OmpC-IgA含量的方法，包括步骤：

(1)用权利要求1-8任一所述的试剂盒进行检测，向OmpC包被的酶标板孔中加入对照品或待测样品溶液，再加入酶标记的抗人IgA抗体，孵育后洗涤拍干，加入显色剂、终止液，用酶标仪或化学发光仪测定吸光度值；

(2)分析检测结果。

本发明试剂盒的检测原理为：

将OmpC包被在固相载体上，加入待检测样品或对照品，样品或对照品中的抗OmpC抗体就跟固相载体上的OmpC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，用洗涤液去除无关的成分，然后加入酶标记的抗人IgA抗体，酶标抗体与微孔板上的抗原-抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，通过洗涤出去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中含抗OmpC-IgA抗体的量呈正相关，与阴性对照品和阳性对照品检测所得的值进行比较即可得出样品中是否含有抗OmpC-IgA抗体，以及抗体的含量多少。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地理解本发明，而不是对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

实施例1大肠杆菌OmpC制备

试剂及仪器

1)试剂

大肠杆菌宿主菌DH5α、BL21(DE3)，克隆载体pCR2.1T-vector，表达质粒pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性内切酶BamH I、Hind III和EcoR I、BamH I，DL2000DNA Marker、T4DNA连接酶，低分子量标准蛋白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等

2)仪器

普通摇床SCS-24；隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge 5810R、台式离心机MiniSpin；高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统；PCR仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。

3)实验方法

载体构建

设计引物ATTG GATC CGCT CCGAAAGA和TCTC GAGT TAAG CCTG CGGCT从模板DNA中PCR扩增出OmpC片段，胶回收试剂盒回收片段后连接到pCR2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中，酶切位点为EcoR I、BamH I，同时载体上有6×HIS标签，便于后续的蛋白纯化。

表达