[发明专利]华南美丽葡萄花青素还原酶基因及其编码的蛋白与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及通过合成华南美丽葡萄cDNA、PCR和重组表达技术获得花青素还原酶基因及其编码产物，属于分子生物学和植物基因工程领域。

背景技术

植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，经济作物次生代谢合成相关功能基因的研究成为热点领域之一，这些基因的克隆将为解析经济作物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释作物品质的形成提供理论依据，同时为利用生物技术进行作物品质改良、分子遗传育种和作物抗逆性等带来广阔的应用前景。

原花青素(Proanthocyanidins，PA)又称缩合单宁，是高等植物特有并广泛存在的聚多酚类化合物。具有抗紫外线、抗病、抗虫、清除自由基、调节种子休眠和萌发等生理功能；从食物中摄取寡聚原花青素可以抗衰老，预防心血管疾病、癌症、阿兹海默氏病等疾病，享有多方面的保健和药用价值。花青素还原酶(anthocyanidin reductase，ANR)是原花青素类化合物合成下游途径中的关键酶，也是原花青素单体合成的直接酶类，在原花青素生物合成途径中具有重要的调节作用。

葡萄除作为重要的经济作为外，其葡萄籽和皮中原花青素含量丰富，是提取原花青素的主要原材料。目前，我国葡萄种植主要为欧洲品种，本土丰富的野生资源未有得到开发利用。因此从野生葡萄资源中获得花青素还原酶基因，将为通过代谢工程手段改良葡萄或其他作物品质和分子遗传育种等提供重要基础。在本次发明公布之前，仅有欧洲酿酒葡萄(Vitis vinifera)有关花青素还原酶基因的报道，尚未有公开或报道过野生葡萄--华南美丽葡萄(Vitis bellula)花青素还原酶基因及其氨基酸序列。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因(ANR)及其编码的蛋白与应用。

本发明实施例是这样实现的，一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因，核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO.1的DNA序列；或

(2)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

本发明的另一目的在于提供一种具有上述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的华南美丽葡萄花青素还原酶。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的宿主细胞。

本发明的另一目的在于提供上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因通过转基因技术和代谢工程手段在葡萄或牧草品质改良、农产品脱涩、茶多酚分子育种、作物抗病虫害中的应用。

本发明所提供的花青素还原酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明提供的花青素还原酶基因可以通过生物技术提高葡萄中原花青素类活性成分的含量，同时可以进行牧草品种改良、农产品脱涩、茶多酚的分子育种、作物抗病虫害的提高等，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：华南美丽葡萄总RNA和ANR基因的PCR扩增电泳图；

图2：大肠杆菌表达载体pET-32a(+)/ANR构建图；

图3：重组花青素还原酶表达和纯化SDS-PAGE图；M，蛋白质标准；1，重组菌破壁后上清液；2，重组菌全菌；3，重组菌破壁后沉淀部分；4，空载体重组菌；Trx-VbANR，纯化的重组花青素还原酶；

图4：重组花青素还原酶活性HPLC检测图；a，花青素标准品HPLC图；b，Trx-VbANR酶促反应产物HPLC图(EC，表儿茶素)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的目的在于提供一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因(ANR)。

本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。

本发明所提供的华南美丽葡萄花青素还原酶(ANR)，为以下核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID NO.1的DNA序列；