[发明专利]一个长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一个新克隆的长链非编码RNA基因序列的应用方法。

背景技术

原发性肝癌是亚洲与部分非洲地区的高发肿瘤，其病死率居我国恶性肿瘤的第二位，五年生存率只有5%左右，肝癌的防治及其发病机制研究一直是我国医学科学研究中的重要课题。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的一种主要类型，尽管目前在肝细胞癌的诊断和治疗方面有了新的进展，但是对于其发生发展及转移的确切机制仍然存在大量未知的问题。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，研究发现很多lncRNA在肿瘤的发生发展中有重要调节作用，它具有抑制肿瘤生长和促进肿瘤转移等生物学作用。lncRNA根据其基因位置可分为五种类型：正义lncRNA(sense lncRNA)、反义lncRNA(antisense lncRNA)、双向lncRNA(bidirectional lncRNA)、基因内lncRNA(intronic lncRNA)及基因间lncRNA(intergenic lncRNA)。之前一直被认为是转录“噪音”的lncRNA，因在基因调节中的重要功能，目前已成为继miRNA之后非编码RNA领域又一研究热点。近年的研究已表明，lncRNA参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。lncRNA有望成为肿瘤诊断、治疗和预后新的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。

新一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术的迅猛发展将基因组水平的研究带入了一个新的阶段，许多基于全基因组的研究成为可能，RNA测序(RNA-Sequencing，RNA-Seq)就是利用新一代测序技术对生物样品转录的全部RNA进行高通量测序，以获得被测样品转录组(transcriptome)数据的一种重要新技术。

最近我们利用新一代测序技术对肝细胞癌患者活检标本及正常对照肝组织样品进行RNA-Seq，在肝癌样品中检测到染色体11q13.1区域存在相邻的几个明显RNA-Seq信号峰，而在正常对照组织中却没有，且该染色体区域目前尚无已知基因登录，提示可能存在一个或多个未知的新基因。我们以此为线索，证实这几个RNA-Seq峰来自同一个新基因，并克隆了该基因全长序列。该基因全长序列为3526bp，可转录成多个转录本，将该基因全长的序列输入ORF finder软件进行开放阅读框预测，未发现明显的开放阅读框，说明该基因编码一个长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。

我们从肝癌及正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了该lncRNA的表达情况，结果显示该lncRNA在肝癌组织中表达上调（P<0.001）。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在大样本中验证了该lncRNA在肝癌中表达显著上调（P<0.001）。因此针对该lncRNA的检测制剂可用于肝癌的辅助诊断。生存曲线分析发现该lncRNA表达高的患者其生存时间短于该lncRNA表达低的患者（P=0.024）。因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于肝癌的预后判断。

我们还针对该lncRNA基因的序列设计了用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体，利用该载体在肝癌细胞系中抑制了该lncRNA的表达，且发现抑制该lncRNA表达可抑制肝癌细胞系的生长。因此针对该lncRNA的抑制制剂也具有肝癌基因治疗的潜在用途。

发明内容

本发明的目的是提供一个新克隆lncRNA基因的应用方法，具体是该长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法；根据该基因序列，设计并合成了用于RNA干扰封闭该长链非编码RNA表达的短发夹结构RNA真核表达载体，利用该载体成功地在肝癌细胞系中抑制了该长链非编码RNA的表达。

一个长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法，根据该长链非编码RNA基因制备了用于干扰其表达，并导致抑制肝癌细胞生长的制剂；该基因转录本序列为序列表中SEQ ID NO：1-12所示的核苷酸序列中的任一条；或者是与序列表中SEQ ID NO：1-12任一条所示的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是与序列表中SEQ ID NO：1-12任一条所示的序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。