[发明专利]一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体地，涉及一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。

背景技术

稻田杂草与水稻在水、肥、生长空间上进行竞争，直接影响水稻的产量。近年来直播和抛秧等栽培方法的使用，使得稻田的杂草危害变得日益严重；特别是新型稻田杂草--杂草稻--的出现，给稻田除草提出了难题。另外，随着农村人口往城市迁移速度的加快，水稻种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草的方法变得不现实。施用除草剂是解决这些新出现的问题的最佳方案之一，因此，抗除草剂水稻将具有非常大的实际需求和市场潜力。

草甘膦（glyphosate）别名N-(膦羧甲基)甘氨酸；农达（Roundup）；镇草宁；膦甘酸，是一种非选择性、无残留、灭生性除草剂，对多年生根杂草非常有效，广泛用于橡胶、桑、茶、果园及甘蔗地。施用草甘膦后，进入植物体内的草甘膦分子与磷酸烯醇丙酮酸竞争性地结合EPSPS（5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶）的活性位点，终止了芳香族氨基酸的合成途径，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最终导致植物死亡。利用源于细菌、植物抗性细胞系的Epsps基因可以大大提高植物对草甘膦的耐受性。在转基因抗除草剂作物的研制中，最负盛名、推广面积最大、经济效益最高的是抗草甘膦作物。现已研制成功的抗草甘膦作物有：大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、水稻、烟草、花生、番茄、马铃薯、向日葵、胡萝卜、洋葱、春小麦、苜蓿、波菜、南瓜、百脉根等20多种植物。由于抗草甘膦作物在世界各地的推广与大面积种植，影响了除草剂新品种的筛选与开发、世界除草剂销售市场以及食品工业，还引起了作物栽培方式及耕作制度的深刻变革。可以预见其耐性基因工程的市场前景广阔（Wang X J,Lang Z H,Shan A S,Huang D F.Advances in mechanism of herbicide inhibiting amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant transgenic plants.China Biotechnology,2008,28（2）:110-116.）

目前的水稻遗传转化方法主要是用以潮霉素为筛选剂的农杆菌介导法。例如HieiY，Ohta S,Komori T.Efficient transformation of rice（Oryza sativa L.）mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA.[J]Plant Journal，1994（6），通过潮霉素筛选，获得粳稻“越光”的转基因植株；沈革志,张建军,殷丽青,等.根癌农杆菌介导Ds转座因子的水稻遗传转化[J].上海农业学报.1998（04）；刘巧泉,等.根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立[J].植物生理学报.1998（03）获得“中花11”的转基因植株；孙建昌,马静,何玉科,等.农杆菌介导法转化宁夏水稻的研究[J].宁夏农林科技.2009（01），获得“优育28”的转基因植株。但是利用该筛选方法培育出的转基因水稻会带入多余的筛选标记基因，给未来的品种应用带来麻烦。也有少量转化方法以Bar基因作为筛选标记基因，用除草剂草丁膦作为筛选剂得到抗草丁膦的转基因水稻植株。例如文献【黎垣庆,刘刚,严文贵,等.转bar基因水稻除草剂抗性遗传研究及其应用[J].杂交水稻2000（01）、查中萍,万丙良,殷得所,等.农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得[J].湖北农业科学.2011（24）】。相对于草丁膦，草甘膦具有价格便宜，在土壤中易分解、无残留，对生态环境的潜在影响小等优点，从而成为了世界范围内施用面积最大的除草剂，这也为抗草甘膦除草剂作物的培育提出了更高的要求，迫切需要一种大规模商业化生产抗草甘膦水稻的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现：构建包含草甘膦抗性基因Epsps-1和Epsps-2的遗传转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法、以草甘膦作为筛选剂，成功地将草甘膦抗性基因转入到水稻愈伤组织中，并培育出抗草甘膦除草剂的转基因水稻植株，借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株，Southern Blot方法鉴定外源基因拷贝数，试纸条检测Epsps-1或Epsps-2蛋白表达情况，分子鉴定结果显示外源基因已稳定地表达。

本发明提供的抗草甘膦转基因水稻的制备方法，包括以下步骤：