[发明专利]混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及混糖发酵生产L-色氨酸的细菌及发酵方法。

背景技术

L-色氨酸是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在医药领域，L-色氨酸是氨基酸输液的重要组分和重要的医药中间体。在食品应用领域，L-色氨酸可用于强化食品，提高风味，也可用于面包促进发酵。在饲料添加领域，当赖氨酸和蛋氨酸得以满足之后，L-色氨酸成为日粮重要限制性氨基酸，补充外源L-色氨酸可以提高畜、禽、鱼类日粮内L-色氨酸的含量，改善日粮氨基酸组成和比例，提高日粮蛋白质的价值和利用效率。

1979年Tribe和pittard首次利用DNA重组技术将trpE引入大肠杆菌中，L-色氨酸产量达到1g/L。自此之后，随着分子生物学技术的发展，经基因工程改造的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，发酵生产L-色氨酸的效率得到了数十倍的提升。其中Ikeda M等在产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌pIK9960中过表达tktA，增加L-色氨酸合成前体E4P的含量，从而提高L-色氨酸的合成产率，发酵80小时，L-色氨酸产量最高可达到58g/L（Ikead M等，Hyperproduction of tryptophan by corynebacterium glutamicum with the modified pentose phosphate pathway,Applied and environmental microbiology,1999,51:201-206）。Berry A在大肠杆菌中高表达去除反馈抑制的aroG，TrpEDCBA基因，发酵50小时，产L-色氨酸45g/L，对葡萄糖的阶段转化率接近23%（Barry A,Improving production of aromatic compounds in Escherichia coli by metabolic engineering.Trends Biotechnol,14:250-256,1996）。

目前，L-色氨酸多利用基因工程改造的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌通过发酵的方法进行工业化生产。其所使用的发酵培养基中通常包括充足的碳源和氮源。细菌能够利用各种碳水化合物，有机酸和醇作为碳源。在氨基酸发酵领域中最常用的碳源为葡萄糖和蔗糖，其来源为糖浆、谷物、糖蔗、淀粉的水解产物，其价格日渐升高。因此，需要找出更加廉价的替代碳源用于L-氨基酸的生产。

生物质是一种易得且相对便宜的L-氨基酸生产原料。在生物质中纤维素、半纤维素和木质素的常规量为约40-60%的纤维素、20-40%的半纤维素、10-25%的木质素和10%的其他成分。纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，半纤维素是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，这些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。木质素则是由聚合的芳香醇构成的一类物质。近二十年来已有大量的文献和专利或专利申请，通过生物催化剂（细菌和酵母）利用生物质生产乙醇，氨基酸，有机酸等，不少已经进入工业化生产阶段。通过扩增戊糖同化基因，对应阿拉伯糖的araFG和araBAD基因，木糖的基因xylABFGHR（中国专利200510076242.X）可以增加戊糖利用率。但是，上述方法需要在生产菌的基础上，额外进行大片段的克隆及启动子改造，操作复杂，不易实现。

野生型大肠杆菌可以利用戊糖如L-阿拉伯糖或D-木糖作为碳源，但其相关代谢受到严格调控。当培养基中同时存在葡萄糖和戊糖时，大肠杆菌会优先利用葡萄糖，等葡萄糖耗尽后才会利用戊糖。这种情况会表现为细菌的二次生长（diauxic growth）。其分子机制为PTS系统介导的复杂调控系统，其中cAMP为信号分子，CRP（cAMP receptor protein）为受体蛋白，CRP-cAMP复合物为激活蛋白，激活多种戊糖转运和代谢基因。简单而言，当胞外存在葡萄糖时，cAMP的合成受到抑制，cAMP含量很低，不足以形成大量的CRP-cAMP复合物，从而不能有效激活相关基因的转录，当胞外不存在葡萄糖或其他PTS系统的糖时，cAMP的合成被激活，CRP-cAMP复合物得以形成，相关基因的转录能被激活（Escherichia coli and Salmonella,Second Edition,Editor in Chief:F.C Neidhardt,ASM Press,Washingtong D.C.,1996)。

发明内容