[发明专利]一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种用于海洋生物制剂对结肠癌细胞活性的研究的激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法。 

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类生命、引发死亡的重大疾病。目前研究较深入的靶点主要针对肿瘤细胞自身特点的生长抑制、肿瘤血管新生、人体免疫系统、DNA与蛋白质合成等。近年来，靶向抗肿瘤新药的研发与创制进展迅速，其中有机小分子化合物从最初的细胞毒作用逐渐发展到目前作为各类靶点的抑制剂，始终是抗肿瘤药物的研究热点。 

陆生资源日益枯竭，陆地植物中寻求新骨架化合物几率急剧下降。海洋生物的多样性及环境高盐、高压、缺氧和避光的特点导致海洋生物次级代谢产物的生物合成途径及酶催化反应机制方面具有特异性，成为新药和先导化合物的来源。近年来，海洋生物的提取产物为新药研制提供了大量的先导化合物，但是这些提取物的抗癌谱窄，多数缺乏靶向性，因此从海洋中分离提取出结构新颖、抗癌谱广的靶向抗肿瘤药物是抗肿瘤药物开发的重点领域。 

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法系统，以解决上述背景技术中的缺点。 

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现： 

一种激酶抑制剂对结肠癌细胞活性的检测方法，主要从两个部分进行，第一部分，筛选出对激酶抑制剂最敏感的癌细胞株；第二部分，建立肿瘤动物模型，考察激酶抑制剂的体内抗肿瘤活性。

其中，在第一部分中，采用MTT法来研究激酶抑制剂对癌细胞株活性的影响。 

四唑盐的还原是目前被广泛的一种可靠的检测细胞增殖的方法，MTT(3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量，具体操作如下： 

1）培养细胞：采用含10%胎牛血清的培养基（人结肠癌SW620细胞与人肺腺癌A549细胞的培养基是RPMI-1640，宫颈癌Hela细胞的培养基是高糖DMEM），于37℃、5%CO₂的培养箱中贴壁培养。

2）接种细胞：用胰酶消化液消化，形成单细胞悬液。取一定量对数生长期SW620细胞、Hela细胞和A549细胞）接种于96孔板中，于37℃，5%CO₂的培养箱中培养，过夜。 

3）药物配制：将激酶抑制剂用DMSO溶解，配制激酶抑制剂的母液（6.4×105 μmol/L）。用细胞培养液稀释母液，最终配制浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、64μmol/L的激酶抑制剂培养液，DMSO的最终含量≦0.1%。 

4）MTT溶液的配制：无菌条件下，在50ml离心管中加入20ml磷酸盐缓冲液，从中先吸取1ml磷酸盐缓冲液装入含MTT的小管中，使MTT尽量溶解，再转移到50ml离心管中，用纯净的磷酸盐缓冲液涮洗小管3次，将洗液混合后，定容到50ml，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，避光分装成1ml/管，(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。 

5）药物干预：吸除96孔板中旧细胞培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2遍，添加含药物培养液干预细胞，同时设置阴性对照孔和调零孔，每个浓度设置6个复孔。 

6）分别培养24、48、72 h后，去除旧培养基，每孔添加200 μL不含血清的培养基和20 μL MTT溶液，于37℃，5%CO²的培养箱中避光孵育4~6 h。 

7）小心吸除原液后，每孔添加150 μL DMSO，摇床上轻摇10 min，ELx 800 NB酶标仪检测490 nm波长下的吸光值（OD），计算抑制率与半数抑制浓度IC50（IC50指细胞增殖抑制率为50%时药物的干预浓度）。 

其计算公式为： 

其中，IC50值通过Excel模拟出趋势线，得到趋势线的公式，计算IC50值。以该浓度作为后续实验的干预浓度。