[发明专利]底物蛋白SNVP及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种梭菌属神经毒素底物蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种将SNAP-25蛋白与VAMP-2蛋白融合后得到的梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）底物蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是世界上已知毒性最强的物质，由肉毒梭状芽孢杆菌（clostridium botulinum）在厌氧条件下产生，共有7种血清型（A-G），其中引起人类致病的主要是A、B型，能引起严重的中毒症状，死亡率高达40%，人体的半数致死剂量LD50仅为0.1-1ng/kg。中毒通常表现为眼部及喉部肌群的麻痹，然后发展为全身骨骼肌麻痹，最终由于呼吸衰竭而死。近几年，肉毒中毒事件时有发生，虽然肉毒中毒主要以食物污染、伤口感染、婴儿肠道中毒等方式出现，但由于肉毒毒素的毒性强烈，易于制备获得，使得其成为潜在的生物恐怖剂之一。

肉毒毒素由肉毒梭状芽孢杆菌产生，最初是以无毒的单链多肽形式存在，约150kDa，之后经菌体蛋白酶或体外蛋白酶作用，将毒素前体消化成为由一个二硫键相连的双链形式多肽存在才具有毒性，包括通过羧基端与靶细胞受体结合并通过氨基端介导细胞内吞将毒素转运至细胞内部的重链部分（Heavy chain，Hc），约100kDa，以及具有锌依赖内肽酶活性的轻链部分（Light chain，Lc），约50kDa，可以特异切割靶细胞内肉毒毒素的底物，而发挥神经毒力。其中，重链是毒素的非毒性部分，而轻链则是毒素的毒性部分。肉毒毒素的底物根据其血清型不同而不同，并且针对同一种底物的几种不同血清型毒素各自的作用位点也不同。A、E、C型肉毒毒素作用的底物为突触小体相关蛋白（Synaptosomal associated protein of molecular mass25kDa，SNAP-25），作用位点分别为：A型：Q197-R198；E型：R180-I181；C型：R198-A199；B、D、F、G型肉毒毒素作用的底物为囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein，VAMP or Synaptobrevin），作用位点分别为：B型：Q76-F77；D型：K59-L60；F型：Q58-K59；G型：A81-A82。另外，与肉毒毒素同为梭菌属神经毒素的破伤风毒素的作用底物也为囊泡相关膜蛋白，其作用位点与B型肉毒毒素作用位点相同。再有，C型肉毒毒素还可以切割可溶N2乙基马来酰亚胺敏感因子胞膜整合蛋白（Syntaxin），位点为K253-A254。这些底物共同被称为SNARE蛋白，在介导小泡定向和融合方面起重要作用。

实现对于微量肉毒毒素的快速、准确的检测分析，是及时准确采取防治措施、减少其危害的前提和最重要的手段之一。迄今为止，对于肉毒毒素的检测分析法中，唯一公认的金标准是小鼠分析法（mouse bioassay），这种分析方法主要通过向小鼠腹腔注射待测样品，进而观察小鼠是否出现中毒症状，如出现蜂腰，皮毛倒立，呼吸微弱，四肢麻痹，甚至死亡等症状，从而分析待测样品中毒素量的多少并用特异抗体确定型别如何，可以实现对皮克级（pg）毒素的分析。虽然传统金标准对绝大部分样品分析的结果都是真实可靠的，但也存在许多限制，主要表现在成本高（动物饲养条件要求高，操作人员专业技能要求高），耗时长（需要4天），样品需要量大，不易推广等，无法满足突发公共卫生事件中样本应急分析的要求，因此亟需简便、快速、灵敏的新技术方法实现对传统金标准的有效替代。

近几年，国内外许多学者在肉毒毒素的分析方法方面开展了相关研究，也已经有一些新型的分析方法问世，除了上面提到过的传统金标准外，主要包括：（1）内肽酶活性分析法（endopeptidase activity assay），可以使用人工合成或重组表达的含有特异血清型酶切位点的肽段作为底物，利用检测标记的荧光信号等方法对待测样品中毒素进行分析；（2）质谱分析法，对毒素酶解底物产物直接进行检测，可以达到小鼠分析法的灵敏度甚至更高，但依赖特殊设备，且其结果容易被待测样品中其他物质所干扰；（3）细胞分析法，可以体外模拟肉毒中毒的过程，解决了小鼠分析法使用大量动物的问题，但操作较复杂，耗时长。目前，这些方法和配套试剂产品多数是针对特定的血清型毒素进行检测分析，还没有简便应用单一检测产品可以覆盖所有血清型毒素的检测系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）底物蛋白及其编码基因与应用。