[发明专利]应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法

权利要求书

1.一种应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1步骤，克隆秦川牛固醇调控元件结合蛋白1基因（SREBP1）；

A2步骤，psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建；

A3步骤，靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成；

A4步骤，pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建；

A5步骤，shRNA干扰效率的测定、筛选；

A6步骤，重组腺病毒载体的构建；

A7步骤，腺病毒包装、扩增、滴度测定；

其中：所述A1步骤包括：

步骤A11，设计、合成PCR扩增引物，具体执行以下操作：

根据GenBank收录的牛的SREBP1基因序列（Accession NO.NM_001113302）用Primer5.0软件设计PCR扩增引物，在上游引物加PmeI酶切位点，下游引物加NotI酶切位点，引物序列如下：

SREBP1-PmeI-F：AGCTTTgtttaaacTGACTGCGCCATGGACGAGC；

SREBP1-NotI-R：AAGGAAAAAAgcggccgcTGATACGGAGACC；

其中引物序列中的小写字母为外加酶切位点；

步骤A12，PCR扩增SREBP1基因，具体执行以下操作：

用KOD-Plus-Ver.2高保真聚合酶PCR扩增SREBP1基因，PCR反应体系为：cDNA模板1.2μl，上下游引物各0.6μl，25mM MgSO₄1.2μl，2Mm dNTP2μl，10×PCR Buffer2μl，ddH₂O12μl，KOD-Plus-（1U/μl）1μl，总反应体系20μl；

PCR反应条件为：

95℃，3min；

95℃，30s，66℃，30s，72℃，210s，共33个循环；

72℃，5min；

取3μl PCR产物电泳检测并胶回收，-20℃保存备用；

步骤A13，PCR产物与19-T Simple Vector连接，具体执行以下操作：

取回收产物5μl，加入1μl普通Taq聚合酶混合物（MIX），72℃条件下，加“A”反应10min，将加“A”产物与19-T Simple Vector16℃于过夜连接，转化感受态E.coliDH5α，挑取单克隆菌落扩繁，取5ml菌液提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A2步骤具体执行以下操作：

用PmeI和NotI分别双酶切19-T-SREBP1质粒和psiCHECK-Ⅱ质粒，胶回收SREBP1基因和psiCHECK-Ⅱ酶切片段，多功能酶标仪测定回收产物浓度，用T₄DNA连接酶将二者回收产物16℃过夜连接，取连接产物10μl转化100μl感受态E.coliDH5α，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加入890μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，取200μl菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养皿上，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，在5mL含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养12-16h，提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3具体执行以下操作：

根据GenBank公布的牛的SREBP1基因序列，设计6对条shRNA及1对阴性对照单链DNA寡核苷酸序列，每对单链DNA寡核苷酸序列两端分别添加BamHI和XhoI酶切位点，其中正义链中间添加发夹环序列“TCAAGAG”，3'端加终止信号“TTTTTT”，得到shRNA的正、反义单链模板并合成。