[发明专利]一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术、生物药物领域，具体地，本发明涉及人强效抑制剂SARI(Suppressor of AP-1,Regulated by IFN)蛋白和B细胞激活因子（B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF）的突变后的蛋白msBAFF组成的抗恶性淋巴瘤融合分子，及其制备方法。

背景技术

恶性淋巴瘤严重威胁人类生命健康。迄今为止，用于治疗这些疾病的主要方法仍是放疗、化疗，但放疗、化疗同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞，毒副作用极大。肿瘤的生物治疗是一个充满希望的研究领域，它对克服肿瘤治疗中的毒副作用，提高治疗效率具有不可忽视的作用。近年来，有关AP-1和BAFF的研究为这一目标的实现提供了新的途径。

激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是生物体中细胞核内重要的转录因子，参与靶基因调节。AP-1在包括恶性淋巴瘤在内的90%以上的肿瘤细胞中过度表达,是C-MYC、MMP1、MMP3、TNF、TSG6等多种肿瘤相关基因的转录调控因子。调控上述多种基因的表达,对细胞的增殖、浸润转移、凋亡及转化、免疫调节、分化方面起着重要作用，在肿瘤发生发展的基因活动网络中具有关键作用。因此，AP-1的活化与肿瘤密切相关，被认为是进行肿瘤治疗的重要新靶标。最新研究发现，AP-1的强效抑制剂SARI（Suppressor ofAP-1,Regulated by IFN)只选择性诱导肿瘤或表型转化细胞凋亡，而不杀伤人类正常细胞亦无毒副作用。

BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family）是TNF家族成员，有膜结合型和可溶性两种形式，二者的生物学活性基本一致。人BAFF全长为285个氨基酸。近年研究表明，BAFF过表达与恶性淋巴瘤的发生密切相关。在人天然BAFF中，217-224八个氨基酸对该分子活化淋巴细胞至关重要，已有实验证实这八个氨基酸残基被两个甘氨酸残基替换后所得到的BAFF突变体（msBAFF）只能结合BAFF受体，而不能活化淋巴细胞。此突变体在体内可竞争与受体的结合，从而阻断BAFF的生物学活性，抑制淋巴细胞的活化与增殖，因而目前已开始考虑用其作为治疗BAFF相关疾病的竞争性抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其包含人激活蛋白-1的抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。

所述抗恶性淋巴瘤融合蛋白，优选地，在所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI和突变蛋白msBAFF之间连接有TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。所述TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD的编码序列优选为SEQ ID NO:6所示的序列。

本发明所述的抗恶性淋巴瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供上述的重组融合蛋白的制备方法，主要包含以下步骤：

1）提取人外周血单核细胞的总RNA并将其反转录为cDNA；

2）以步骤1）中的cDNA为模板，使用SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列为引物扩增人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA；

3）将步骤2）所得的人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA及含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体酶切后连接，构建含所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI基因片段和所述突变蛋白msBAFF的基因片段的重组质粒；

其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体；

4）将步骤3）获得的重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达获得所述重组融合蛋白。

其中，步骤3）所述含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体优选为pET28a-G₄S-9R-G₄S-mBAFF，其中G₄S为4个甘氨酸和一个丝氨酸组成的柔性接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；9R为TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。

其中，步骤4）所述大肠杆菌优选为BL21Rossetta菌株。