[发明专利]一种指导铂类药物用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种指导铂类药物用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

铂类药物是对具有生物活性的含铂配合物药物的总称，是目前临床上最常用的肿瘤化疗药物之一，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等。据统计，在我国抗癌化疗治疗方案中，以顺铂为主或有顺铂参加配伍的方案占所有化疗方案的70％～80％。但在铂类药物的临床应用中，却存在治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异，部分患者获益，部分患者耐药并出现严重毒副作用。

铂类药物的药理学机制主要是通过引起肿瘤细胞内DNA的交联，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。而DNA修复是铂类药物耐药性产生的主要原因，参与DNA修复的相关基因（如XRCC1、ERCC1等）的基因型对铂类用药的效果至关重要。另外，铂类用药容易产生听力受损等毒性作用，其风险大小与某些基因的SNP位点有密切关系。美国FDA指明：临床上应用铂类药物之前，必须检测TPMT等基因的相关SNP位点。

因此，肿瘤患者在接受铂类药物化疗之前，进行铂类药物相关SNP基因位点的监测，根据监测结果制定个体化化疗方案，提高肿瘤临床治疗的针对性，减少药物毒副作用的发生，节约宝贵的医治时间。

现有的指导铂类药物用药的多重基因的单核苷酸多态性（SNP）诊断方法主要为基因芯片法、荧光定量PCR（qPCR）和Sanger测序法。

（1）qPCR检测方法：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点是（1）通量低：不适宜多SNP位点的检测；难以设置内控基因。(2)成本较高：探针标记成本高；若需获得所有相关SNP信息，需进行多个检测试验，叠加成本更加昂贵。

(2)基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测。其优点是：（1）高通量并行检测；（2）操作简便快速：整个检测只需4-8小时基本可以出结果。缺点：1）不同SNP位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制；2）技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3）重复性差，准确性低，易出现假阳性假阴性结果；4）灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5）由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。

（3）Sanger（双脱氧链终止法）测序法：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。其优点是SNP分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，多个SNP位点检测累计价格相对昂贵。

GenomeLab^TMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的表达，能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下优点：

1、高通量：本系统采用双（96孔）板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应（如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点），一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。