[发明专利]猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物工程技术，尤其是涉及一种猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因和利用家蚕生物反应器表达猪IFNγ-Fc融合蛋白的方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、γ三种。其中干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，在机体免疫系统中发挥重要作用。但由于干扰素分子量小、吸收快、半衰期短、容易被酶水解等特点，在临床中需要频繁注射给药才能达到治疗的效果。

IgG免疫球蛋白是体内的主要抗体，IgG的Fc片段可以和新生的Fc受体（FcRn）结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fc片段可以用来与IFNγ连接构成融合蛋白，以提高IFNγ在体内的半衰期，达到长效作用的目的；同时IgG可以通过Fc片段上的补体集合位点激活补体，起到细胞杀伤作用；此外，带Fc片段的IFNγ融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。

目前猪干扰素的批量生产主要有诱导血液淋巴细胞法和大肠杆菌异源表达法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂、生产成本高，产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。相比之下，大肠杆菌异源表达法具有产量大、纯度高、适合规模化生产、产品质量容易控制等优点，但是其生产工艺相对较繁琐。并且，由于大肠杆菌体系内缺乏蛋白翻译后加工系统，表达产物多以无活性的包涵体形式产生。而包涵体的复性过程复杂、复性率低，从而导致蛋白比活性也较低。另外，大肠杆菌表达体系的产品纯度不高，含有其他杂蛋白，分离纯化较困难。而杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统，具有表达效率高、表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使目的蛋白在生化性质及生理活性方面与天然蛋白基本相似、生产成本较低等优点，从而为基因工程干扰素在畜禽养殖业中广泛奠定了基础。因此，本发明提供了一种新颖的猪IFNγ-Fc融合蛋白杆状病毒表达体系——家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因，以及利用杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统高效表达、生产猪IFNγ-Fc融合蛋白的方法。

本发明提供了一种猪IFNγ-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有猪γ干扰素蛋白序列的成熟肽部分，同时，在猪γ干扰素蛋白序列C端的终止密码子之前添加有Fc蛋白序列。

本发明的上述所述猪IFNγ-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种猪IFNγ-Fc第一优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种猪IFNγ-Fc第二优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种猪IFNγ-Fc第三优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种质粒，所述质粒含有上述所述的猪IFNγ-Fc第一、第二或第三优化基因，所述质粒优选为Bacmid。

本发明还提供了一种病毒，所述病毒具有上述所述的质粒，所述病毒优选为杆状病毒，最优选为BmNPV。

本发明还提供了一种猪IFNγ-Fc融合蛋白的表达方法，包含如下步骤：

（1）在合适的条件下将上述所述的病毒转染家蚕BmN细胞或穿刺接种家蚕幼虫；

（2）家蚕BmN细胞或家蚕幼虫表达猪IFNγ-Fc融合蛋白。

优选的，所述表达方法步骤如下：

（1）将猪IFNγ-Fc第二优化基因或第三优化基因克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统转移表达载体pFastBac Dual中；

（2）通过位点的特异性转座，将转移表达载体上的所述猪IFNγ-Fc第二优化基因或第三优化基因整合入Bacmid杆状病毒质粒完成病毒基因组的重组；

（3）将步骤（2）中整合了猪IFNγ-Fc第二优化基因或第三优化基因的杆状病毒质粒转染家蚕BmN细胞，获得重组杆状病毒并完成重组杆状病毒的扩增，并用杆状病毒穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫；所述家蚕幼虫优选为4或5龄的家蚕幼虫；