[发明专利]人白细胞介素29成熟肽第33位赖氨酸、35位精氨酸定点突变为精氨酸、赖氨酸的变异体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种人白细胞介素29成熟肽第33位赖氨酸、35位精氨酸定点突变为精氨酸、赖氨酸的变异体(hIL-29Z)及其制备方法，属于生物工程领域。

背景技术

人白细胞介素29(Interleukin29，IL-29)是近年发现的一种新的细胞因子，又称为干扰素λ(Interferon29，IFNλ1)，其与IL-28A和IL-28B同属于IFNλ家族(IFNλs)。

研究发现，IL-29通过结合特殊的异二聚体受体复合物起始信号的转导和发挥生物学作用，它和I型干扰素共享相同的Jak-STAT信号传导途径，促进一组共同的基因表达，因此，IL-29表现出一些与I型干扰素相同的性质，如抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤以及免疫调节等生物学活性。

IL-29发挥效应必须与靶细胞表面的相应受体结合，IL-29和IL-28共用一个由IL-28R1和IL-10R2组成的异二聚体受体复合物，其中IL-28R1为结合亚基，对IL-29的细胞应答具有特异性，IL-10R2为辅助亚基，对IL-29的细胞应答无特异性。IL-10R2也是I型干扰素、IL-10、IL-22和IL-26的受体组成部分，其在造血和非造血细胞中普遍表达。

已有研究表明，对IL-28B肽链中的氨基酸残基进行诱变，可使IL-28B变异体的抗病毒活性发生显著改变。由于IL-28B与IL-29的同源性高达81％，而且两者共用相同的受体，因此可根据IL-29的晶体结构以及受体结合部位的序列分析，采用定点突变方法对IL-29进行分子改造，可改变其与受体结合的亲和性，从而提高其生物学活性。

分子识别是分子间专一性的结合过程，人们所熟悉的分子识别的三个模型包括抗体与抗原、配体与受体、酶与底物的结合。本发明中，以理论设计的IL-29变异体及野生型IL-29作为配体，采用计算机模拟与靶细胞表面的相应受体结合，预测变异体与受体间的非共价相互作用的结合自由能，根据结合自由能的正负来选择和确定定点突变位点。通过计算机模拟分析，发现IL-29成熟肽的第33位赖氨酸突变为精氨酸、35位精氨酸突变为赖氨酸时，该变异体与受体相结合的结合自由能低于野生型IL-29与受体相结合的结合自由能，由此选择对IL-29成熟肽的第33位、第35位氨基酸进行定点突变。

发明内容

本发明提供了一种人白细胞介素29成熟肽第33位赖氨酸、35位精氨酸定点突变为精氨酸、赖氨酸的变异体(hIL-29Z)及其制备方法。

(1)本发明的第一方面，提供一种hIL-29变异体的重组真核表达载体，该载体是将pPIC9K^M(源于Invitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为：201110410391.0)与本发明所述的hIL-29变异体编码基因(SEQ ID No：1)经过重组而获得，该重组真核表达载体为pPIC9K^M-hIL-29Z，如图1所示；该重组载体表达的产物是肽链中第33位赖氨酸定点突变为精氨酸、35位精氨酸定点突变为赖氨酸的hIL-29变异体(SEQ ID No：2)；而且，本发明将pPIC9K^M的因子中的限制性内切酶Xho I识别位点CTC GAG与蛋白酶Kex2的识别位点GAG AAA AGA(编码产物为Glu-Lys-Arg)，通过PCR方法引入hIL-29变异体编码基因(SEQ ID No：1)的氨基端，使该重组真核表达载体表达的hIL-29变异体(SEQ ID No：2)的肽链不会因引入限制性内切酶位点而增加额外的氨基酸残基。

(2)本发明的第二方面，提供一种表达人IL-29变异体的重组酵母工程菌GS115/hIL-29Z，该工程菌是将本发明所述的重组真核表达载体pPIC9K^M-hIL-29Z转化毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)而获得。pPIC9K^M中的信号肽基因序列与hIL-29变异体的编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达hIL-29变异体至培养液中。

(3)本发明的第三方面，提供一种制备hIL-29变异体肽的方法，该方法包括以下步骤：

a)培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加1.5％(v/v)的甲醇作为诱导剂，诱导重组酵母工程菌分泌表达hIL-29变异体；

b)离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处理；