[发明专利]一种胃癌靶向重组毒素及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是利用基因工程制备胃癌靶向重组毒素。

背景技术

胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。手术是目前唯一根治胃癌的方法，但只有不足1/3的人能够进行手术治疗，对于中晚期病人除进行手术治疗外常配合化疗、放疗等治疗手段；但化疗和放疗副作用太大，往往严重破坏患者的免疫系统。40年前，Moolten FL等提出的免疫毒素概念为癌症的治疗带来一片光明；免疫毒素的策略是利用抗原-抗体、细胞因子-受体的特异性结合，基于肿瘤细胞表面的特殊标志物或特异的受体或与正常细胞受体数量的巨大差异，以其作为靶向使毒素集中于肿瘤细胞周围，最终将肿瘤细胞杀死而对正常细胞无损害。目前许多重组毒素已进入临床试验。美国已有1种药物（DT-IL2，ONTAK）上市，另有15种进入I期以上的临床试验，国内朱平领导的研究小组研制的LHRH-PE40重组毒素正在进行II期临床试验。

在血液肿瘤方面，Anti-Tac(scFv)-PE38 (LMB-2)可靶向杀伤CD25 (IL-2R)阳性细胞，在临床I期试验中对35例的白血病淋巴瘤、霍奇金病患者使用，1例完全缓解，7例部分缓解；RFB4(dsFv)PE38 (BL22)可靶向杀伤CD22阳性的淋巴瘤细胞，16例白血病患者中11例完全缓解，2例部分缓解；IL6(23)-PE40KDEL和IL6(D24)-linker-PE40KDEL是两种新型重组毒素，可选择性杀伤高表达IL-6受体的白血病细胞；抗CD64分子的单链抗体片段(m22)与ETA融合形成m22(scFv)-ETA’可特异性杀伤表达CD64的急性髓性白血病母细胞；TH69与PE融合形成的重组毒素能够诱导CD7阳性的白血病T淋巴细胞凋亡。在实体瘤方面，B3(scFv)-PE38 (LMB-7)、B3(dsFv)-PE38 (LMB-9)能识别表达LeY抗原的乳腺癌、肺癌、结肠癌等肿瘤细胞；e23(dsFv)-PE38(Erb38)、e23(scFv)-PE38KDEL (AR209)都是针对在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌中过量表达的Erb-B2的重组毒素；TGFα-PE40的衍生物TGFα-PE40-8cys目前已经用于膀胱癌的临床I期试验；IGF-I-PE40靶向癌细胞表面的胰岛素样生长因子(IGF-I)，能杀伤乳腺癌细胞、肝癌细胞；IL13-PE38QQR已进入临床试验，适应症为肾癌。

作为活性单元的毒素分子，最常用的为白喉毒素（Diphtheria Toxin，DT）、绿脓杆菌外毒素（Pseudomonas Exotoxin，PE），然而由于成人体内大都预存有DT的抗体，因此DT的应用受到一定限制。PE的高毒性及细胞杀伤机制已得到详细阐述，是制备免疫毒素的一种理想毒素分子：PE是分子量为66kDa的单链蛋白，由613个氨基酸残基组成。PE分三个功能区，即Domain I、Domain II和Domain III，Domain I由Ia和Ib组成，Ia区(1-252aa)是受体结合区，引导PE与靶细胞膜上的受体识别并结合；II区(253-364aa)是跨膜转位区，它由7个α螺旋组成；III区(400-613aa)是酶活性区，具有ADP-核糖基化的酶学活性。

 PE通过以下步骤杀伤细胞：㈠G17取代Ia区与CCK-BR或AnnexinII结合将重组毒素聚集到靶细胞表面，II区使其内化进入细胞内；㈡内化后的PE38KDEL在第279-280位氨基酸处被哺乳动物细胞内的Furin蛋白酶裂解，游离出37kDa的片段；㈢维系毒素结构的位于第265位和第287位半胱氨酸之间的二硫键被还原；㈣第280-313位氨基酸对毒素在胞液中的转位起调节作用，毒素转运至内质网并转运到胞液中，毒素羧基端KDEL结合至胞内选择性受体上，第400-602位氨基酸发挥ADP核糖基化活性，使eEF-2失活，阻止肽链延伸而抑制蛋白质的合成。PE还可以通过其他途径诱导细胞凋亡，当阻断PE对eEF-2的作用后，PE融合毒素仍表现出较强的诱导靶细胞凋亡的功能。PE毒素分子被修饰和改造出现了几种衍生物，主要是缺失Ia区使其失去细胞结合能力，同时使用KDEL序列替换REDLK，增加其内质网亲和性，其细胞毒性增加6倍以上，目前最常用结构有PE40KDEL和PE38KDEL，目的在于减少其分子量、增加细胞毒性、增加分子穿透力和降低体内免疫学反应的副作用。